硝基四氮唑藍(lán)染色法、結(jié)晶紫染色法,、固紫染色法,、及Ziehl-Nidlsen染色法

硝基四氮唑藍(lán)染色法：

感染引起細(xì)胞內(nèi)還原性輔酶I的活力增強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用部位,，導(dǎo)致無(wú)色的四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazoliun test,NBT)被還原為不溶于水的藍(lán)色沉淀物,。這種大塊狀藍(lán)色沉淀物僅見(jiàn)于成熟和幼稚的嗜中性粒細(xì)胞胞漿中。文獻(xiàn)報(bào)道在細(xì)菌和真菌感染時(shí),，嗜中性粒細(xì)胞百分率升高（＞12%）,，康復(fù)期恢復(fù)正常。而病毒和結(jié)合感染時(shí)大多陰性,。NBT測(cè)定還可以作為疾病病程和抗生素療效指標(biāo),。

1、操作步驟如下

①將腦脊液與NBT工作液各0.5ml混合后,，置于腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀器中,。

②37℃水浴箱中孵育15min；

③取出腦脊液細(xì)胞沉淀器,，離心后取下玻片,，空氣干燥；

④MGG染色

2,、主要試劑的制備

①磷酸緩沖液（0.15mol/L);Na2HPO41.52g,， KH2PO4 0.496g，加入9g/L NaCl中之100ml,，溶解后校正PH為7.2.

②NBT染液：臨用時(shí)將2g/L NBT生理鹽水溶液與上液等量混合即成,。

結(jié)晶紫染色法：

結(jié)晶紫染色法操作簡(jiǎn)單，主染核,，變性細(xì)胞染色較淡,。其原理是結(jié)晶紫染色可通過(guò)細(xì)胞的特定攝生法而選擇性地被細(xì)胞核吸收，死亡的細(xì)胞幾乎不吸收結(jié)晶紫燃料,。

具體操作步驟：

①甲醇固定1min

②0.1%結(jié)晶紫水溶液3-5min

③96%乙醇分化2-3

固紫染色法：

固紫染色即（Gram染色,。固紫陽(yáng)性菌（鏈球菌等）染成深藍(lán)色，而奈瑟菌屬如腦膜炎雙球菌,，假單胞菌如綠膿桿菌,、腸道桿菌等則成陰性。

操作步驟

①干片于火焰上稍稍固定

②浸入結(jié)晶紫溶液中0.5-1min

③流水沖洗,；

④浸入Luqol濃碘溶液中1min

⑤96%乙醇溶液中脫色

⑥流水沖洗

⑦浸入品紅溶液中1min

⑧流水沖洗待干,。

溶液的制備

①Hucker結(jié)晶紫溶液。結(jié)晶紫200mg溶于蒸餾水*90ml內(nèi),，再加0.1mol硼酸及硼酸鹽緩沖液10ml（PH9.0）,。此液需新鮮配置,，不得過(guò)頁(yè)。

②Luqol濃碘溶液,。碘化鉀2g溶于蒸餾水10ml內(nèi),，加碘1g，蒸餾水加至300ml,。

③品紅溶液,。蒸餾水100ml中韓品紅200mg。

Ziehl-Nielsen染色法：

抗酸染色（acid-fast stain）1982年由Ziehl-Nielsen*,，因此又稱(chēng)為萋-納氏（Ziehl-Nielsen）染色,，主要針對(duì)抗酸桿菌?？顾釛U菌屬分枝桿菌,，由于菌體壁上含有大量的脂類(lèi)，一般染色不易著色,，但能與堿性品紅染液結(jié)合成復(fù)合物,，可抵抗算脫色作用，成紅色,，背景藍(lán)色,，對(duì)比清晰。

步驟如下：

①圖片干燥后,，火焰或乙醇乙mi固定：

②滴加石碳酸付紅液于玻片上,，火焰上徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰,，5min,；

③崎嶇石碳酸液，流水沖洗,；

④浸入3%的鹽酸酒精中搖蕩至無(wú)紅色脫落為止,；

⑤流水沖洗；

⑥堿性美藍(lán)溶液負(fù)染30s

⑦流水沖洗,，干后鏡檢,。

溶液的制備：

①石碳酸品紅溶液：堿性品紅0.5g、無(wú)水乙醇10ml,、石碳酸5g,、蒸餾水90ml（堿性品紅乙醇飽和溶液10ml，5%石碳酸溶液90ml）

②鹽酸究竟：濃鹽酸3ml,，95%乙醇97ml

③美蘭液,；95%乙醇飽和美蘭液30ml加入10%氫氧化鉀0.1ml，蒸餾水100ml。

注意事項(xiàng)：

①抗酸染色用于細(xì)胞學(xué)圖片上時(shí),，可以適當(dāng)增加標(biāo)本的厚度以提高檢出率,。

②細(xì)胞學(xué)圖片以火焰固定為好。

③品紅加熱不宜過(guò)猛過(guò)長(zhǎng),。因?yàn)槟X脊液中的結(jié)核桿菌比較赤裸，不像痰中結(jié)核桿菌包埋在粘液中,，溫度過(guò)高可使細(xì)菌炸裂和難于辨認(rèn),。

在做北京染色時(shí)（即蘇木精染色）盡量淺染，以免掩蓋紅色桿菌色調(diào),，影響檢出效果,。

⑤該法常用石碳酸付紅染液覆蓋標(biāo)本后加溫，冒蒸汽開(kāi)始計(jì)時(shí),，隨時(shí)添加染液,，保持濕潤(rùn)，防止干燥,，知道5min位置,。染液用量多，操作復(fù)雜,，并容易流到玻片外,，沾污水或試驗(yàn)臺(tái)。針對(duì)傳統(tǒng)的抗酸染色發(fā)的不足,，許多學(xué)者對(duì)染色方法進(jìn)行了改進(jìn),，改良法將石碳酸付紅染色液先在沸水浴中加溫10min，在進(jìn)行染色,，結(jié)果尚可,，可避免以上不足。