大鼠視黃醇結(jié)合蛋白-4（RBP-4）ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書

    本試劑僅供研究使用標(biāo)本：血清或血漿

    試驗(yàn)原理：

    RBP-4試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知RBP-4濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),。先將RBP-4和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育,。洗滌后,，加入親和素標(biāo)記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A,、B,，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中RBP-4的濃度呈比例關(guān)系,。

    試劑盒內(nèi)容及其配制

自備材料

    即用型

    自備材料

    1．蒸餾水。

    2．加樣器：5ul,、10ul,、50ul、100ul,、200,、500ul、1000ul,。

    3．振蕩器及磁力攪拌器等,。

    安全性

    1．避免直接接觸終止液和底物A、B,。一旦接觸到這些液體,，請(qǐng)盡快用水沖洗。

    2．實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品,。

    3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

    操作注意事項(xiàng)

    1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫,。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,，不可保存。

    2．實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質(zhì)。

    3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號(hào)的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用。

    4．使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A,、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器,。

    5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    6．洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。

    7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子,。底物B對(duì)光敏感,，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,，有毒,。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

    8．加入試劑的順序應(yīng)一致,，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣,。

    9．按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。

    樣品收集,、處理及保存方法

    1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

    2,、血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè),。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

    3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

    4,、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎,。1000×g離心10分鐘,，取上清液

    5、保存------如果樣品不立即使用,，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存,，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,，檢測(cè)前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

    試劑的準(zhǔn)備

1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

1. 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

    操作步驟

    1．使用前，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

    2．根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

    3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育1小時(shí),。

    4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

    5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘,。

    6．甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機(jī)洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

    7．每孔加入底物A,、B各50ul,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘,。避免光照,。

    8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果,。

    9．在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

     RBP-4試劑盒 建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

試劑盒性能

    1.靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

    2.特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng),。

    3.重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%。

    結(jié)果判斷與分析

    1,、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

    2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的RBP-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）,，做得相應(yīng)的曲線,，樣品的RBP-4含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,。

    3、檢測(cè)值范圍：0-800ug/ml

    4,、敏感度：1.0ug/ml