Kary Mullis博士也許并沒有想到,，他發(fā)明的PCR技術(shù)能夠在未來三十年保持長盛不衰。這不僅要?dú)w功于DNA聚合酶的發(fā)展,，也要?dú)w功于PCR儀的不斷升級(jí),。如今，反應(yīng)效率提高,，反應(yīng)體積減少,，使得PCR逐漸應(yīng)用在更廣泛的領(lǐng)域。選購PCR儀,，似乎并不是一件難事,。然而，對(duì)于一些關(guān)鍵的參數(shù),，你真的了解它們的意義嗎?

　　快速變溫

　　現(xiàn)在,，快速PCR已成為一種潮流。反應(yīng)時(shí)間從90分鐘縮短到30分鐘,，是受歡迎的,，畢竟誰也不想在預(yù)約PCR儀時(shí)排隊(duì)等太久。溫度循環(huán)是所有PCR的基礎(chǔ),。儀器的變溫速率將決定PCR運(yùn)行的整體速度,。毫無疑問，變溫越快，PCR運(yùn)行也越快,。宣傳資料往往也會(huì)首先展示zui高變溫速率以暗示PCR儀運(yùn)行速度更快,。因此，在拿到參數(shù)表時(shí),，我們*時(shí)間會(huì)留意變溫速率,，也就是升降溫速率。

　　不過,，如果大家留心看,，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)ramp rate前面還會(huì)有一個(gè)Max，這說明制造商公布的是zui大變溫速率,。zui大模塊變溫速率(maximum block ramp rate)表示模塊變溫速率的極限峰值,。在PCR運(yùn)行過程中，上述zui大性能只在極短的時(shí)間內(nèi)可達(dá)到,，那種掐著秒表來計(jì)算變溫速率的方法是不可取的,。因此有誠意的制造商還會(huì)公布平均模塊變溫速率(average block ramp rate)，表示在較長的變溫范圍內(nèi)溫度變化的速率,。這個(gè)參數(shù)沒那么炫目,，但更具參考意義，具有比較價(jià)值,。

　　當(dāng)然,，樣品的變溫速率可沒有模塊那么高。這就好比在爐子上燒水,，爐子很快就達(dá)到100oC以上,，但水可能只有50oC。模塊的熱量傳遞到樣品還需要一定的滯后時(shí)間,。因此,，只根據(jù)模塊溫度編程而不考慮樣品體積的變溫速率并不能算準(zhǔn)確。Applied Biosystems在這一點(diǎn)上就很周道,，提供了另一種參數(shù),，平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者zui大樣品變溫速率(maximum sample ramp rate)。這個(gè)參數(shù)能反應(yīng)儀器根據(jù)體積來控制樣品達(dá)到設(shè)置溫度,、遵循預(yù)設(shè)的實(shí)驗(yàn)方案運(yùn)行的真實(shí)能力,，更有效地評(píng)估PCR儀的真實(shí)性能。

　　以Applied Biosystems ProFlex? PCR系統(tǒng)為例,，96孔和全新3x32孔模塊的zui大變溫速率達(dá)到6.0oC/秒,，而標(biāo)示樣品的zui大變溫速率也達(dá)到4.4oC/秒(1 μl樣品體積)。配合快速PCR試劑,，擴(kuò)增500 bp的片段,，不到半小時(shí)即可完成,。它采用溫度控制算法將樣本體積及反應(yīng)管的厚度考慮在內(nèi)，其實(shí)際模塊溫度高于設(shè)置點(diǎn),，從而使滯后的樣本溫度能夠更快地達(dá)到設(shè)置點(diǎn)(又稱為模塊熱過沖),。算法要才可根據(jù)不同體積使樣本達(dá)到穩(wěn)定的設(shè)置點(diǎn)溫度且無過沖及相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)。

　　溫控準(zhǔn)確

　　對(duì)于PCR反應(yīng)而言,，zui重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性。由于PCR是一個(gè)幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增的過程,，不論是變性,、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對(duì)退火而言溫控顯得尤為重要,。有時(shí),，退火溫度相差1oC，就能帶來迥然不同的結(jié)果,。目前,，市場上的大多數(shù)PCR儀采用Peliter元件加熱，溫度準(zhǔn)確性在±0.2oC左右,。

　　溫度控制算法的性無疑會(huì)影響溫度控制的,。前面提到的模塊熱過沖，需要非常豐富的經(jīng)驗(yàn),，的算法才可使不同體積的樣本達(dá)到穩(wěn)定的設(shè)置點(diǎn)溫度且無過沖及相關(guān)的負(fù)面效應(yīng),。

　　對(duì)于96孔板PCR儀來說，另一個(gè)重要的參數(shù)是溫度均一性,，這指的是各孔之間的溫度差異,。均勻擴(kuò)增反應(yīng)板各孔的能力至關(guān)重要，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)常常被忽略,。如果孔間的溫度條件不一致,，那么我們自然無法通過比較兩個(gè)不同位置的反應(yīng)孔數(shù)據(jù)，而得到可靠的結(jié)論,。大多數(shù)儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間,。比如，Eppendorf的Mastercycler Pro S,，在20-72oC時(shí),，均一性≤ ±0.3oC，在95oC,，均一性≤ ±0.4oC,。

　　對(duì)于梯度PCR而言，溫度準(zhǔn)確性的要求似乎更高,。梯度PCR儀zui先由Eppendorf公司在1998年研發(fā)成功推向市場(Mastercycler Gradient),。通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增,，從而一次反應(yīng)就可以篩選出的退火溫度，優(yōu)化實(shí)驗(yàn),，在節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間,。

　　傳統(tǒng)的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個(gè)Peltier元件組成，對(duì)它們?cè)O(shè)置不同的溫度,，通過熱傳導(dǎo)可形成溫度梯度,。不過，由于均勻的金屬加熱模塊兩端設(shè)置的高溫和低溫之間的熱學(xué)相互作用,，無法實(shí)現(xiàn)真正的線性梯度,。實(shí)際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度,，列間的溫度差異不一致使其難以確定優(yōu)化后的真實(shí)退火溫度,，尤其是在優(yōu)化難以處理的試驗(yàn)時(shí)。

　　Applied Biosystems在這方面就有獨(dú)到的設(shè)計(jì),，它的VeriFlex加熱模塊有zui多有6個(gè)獨(dú)立的加熱/冷卻模塊,，由溫度控制器單獨(dú)控制。各個(gè)Peltier模塊之間用隔熱材料進(jìn)行物理隔離,，使得相鄰的Peltier模塊間的溫度干擾zui小化,，溫度控制更加。VeriFlex技術(shù)可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率,。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致,，確保優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件在隨后的日常運(yùn)行中也表現(xiàn)出一致的結(jié)果。

　　研究人員的另一個(gè)噩夢(mèng)是PCR反應(yīng)會(huì)蒸發(fā),。這種蒸發(fā)現(xiàn)象使PCR反應(yīng)體系中各組分濃度升高,，特別是引物濃度升高，直接導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR儀則采用vapo.protect技術(shù),，防止PCR反應(yīng)體系的蒸發(fā)。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材,，各種不同形狀的PCR耗材都能實(shí)現(xiàn)覆蓋,。這種技術(shù)提高了結(jié)果的重復(fù)性，是小體積擴(kuò)增的理想之選,。Applied Biosystems則是通過熱蓋的自動(dòng)調(diào)節(jié)和凹形設(shè)計(jì)確保PCR管的密封,，基本上市場面上常見的PCR耗材都可以使用。當(dāng)然,，通常廠家會(huì)建議使用Applied Biosystems自己的PCR耗材,，畢竟是經(jīng)過廠家多重測(cè)試的，肯定也不會(huì)錯(cuò),。

　　靈活更換

　　雖說PCR儀已逐漸設(shè)計(jì)成個(gè)人化的儀器,，但真的是實(shí)驗(yàn)室中人手一臺(tái),，顯然并不太實(shí)際。實(shí)驗(yàn)室中通常有多個(gè)課題,，每個(gè)人的應(yīng)用也各不相同,，因此PCR儀能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數(shù)人的選擇,，但未來有什么樣的需求,，當(dāng)下并不清楚。抱著開放的心態(tài),，選擇一臺(tái)靈活的PCR儀,，也許是明智的。

　　許多PCR儀都允許更換樣品模塊,，包括96孔、雙48孔和384孔等,。對(duì)于有些儀器,，各個(gè)模塊之間是獨(dú)立的，就像多臺(tái)PCR儀一樣,，可設(shè)置不同的運(yùn)行程序,。比如，Applied Biosystems的ProFlex PCR系統(tǒng)就提供3 x 32孔獨(dú)立模塊,，允許同時(shí)運(yùn)行3組實(shí)驗(yàn),，每組*獨(dú)立，互不干擾,。這種設(shè)計(jì)提高了效率,，讓苦苦等待成為過去。另外,，除了標(biāo)準(zhǔn)的96孔模塊,，它還提供雙96孔和雙384孔模塊，滿足高通量的測(cè)序需要,。此外還有雙槽式模塊可供選擇,，支持QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)使用的芯片

　　Bio-Rad的C1000 Touch PCR儀也提供4個(gè)可互換的模塊，包括96孔,、96深孔,、48孔和384孔。96深孔模塊可容納0.2或0.5 ml PCR反應(yīng)管,，使反應(yīng)體積zui高可達(dá)125 μl,。這種大的反應(yīng)體積適合新一代測(cè)序或芯片的樣品制備。

　　美好體驗(yàn)

　　性能要,，操作可得簡單,，這也是PCR儀選購時(shí)一個(gè)重要的考慮因素,。畢竟，實(shí)驗(yàn)室里用戶的水平參差不齊,，既有經(jīng)驗(yàn)豐富的老手,，也有剛剛?cè)腴T的新手。操作直觀,、輕松編程,，相信是每個(gè)人的愿望。

　　幸運(yùn)的是,，如今的制造商在設(shè)計(jì)時(shí)都考慮到這一點(diǎn),，紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習(xí)慣,，但大多數(shù)人享受著這種隨便點(diǎn)點(diǎn)就能設(shè)置好程序的過程,。之前，Veriti PCR儀作為市場上*款觸摸屏PCR儀,，在推出時(shí)就受到很多客戶的歡迎,。斯坦福大學(xué)的博士后Hugo Hilton曾表示：“觸摸屏顯示很直觀，讓用戶對(duì)反應(yīng)過程一目了然,?！彪S后Bio-Rad也相繼推出了C1000和T100觸摸型PCR儀。隨著觸摸屏技術(shù)的快速發(fā)展,，越來越靈敏,、能快速反應(yīng)的PCR儀也隨之產(chǎn)生，比如Applied Biosystems的ProFlex和SimpliAmp,，那感覺和iPad是一樣一樣的,。

　　遠(yuǎn)程訪問也增強(qiáng)了用戶體驗(yàn)，它讓用戶能夠通過智能手機(jī)或平板電腦,，調(diào)整操作并查看初步結(jié)果,。在使用ProFlex PCR系統(tǒng)時(shí)，你就能通過免費(fèi)的My ProFlex手機(jī)客戶端,，從你的辦公室,、會(huì)議室、家里,，甚至其他任何地方進(jìn)行遠(yuǎn)程連接,，查看PCR實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行情況，或查看哪個(gè)模塊可以使用,。

　　隨著PCR的應(yīng)用越來越廣泛,，人們也希望將PCR儀帶出實(shí)驗(yàn)室，帶到診所和田間,。一些制造商也推出了便攜的PCR儀,，如Ahram Biosystems,。不過，在大多數(shù)情況下,，儀器還是擺在擁擠的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,。而且，一些必要的組件是不可少的,，比如加熱元件,、電源等。因此,，高性能的PCR儀還是占有一定的體積,。不過，如今連測(cè)序儀都跟U盤一般大了,，還有什么是不可能的呢,。

　　過去三十年，PCR已經(jīng)帶給了我們很多的驚喜,。未來,，儀器性能會(huì)更高，操作會(huì)更簡便,，功能會(huì)更多樣，只是,，選擇會(huì)更困難,。擦亮雙眼，看看你真的需要什么,，再做決定吧,。