大鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

試劑盒使用說明書

l  本試劑盒僅供科研使用。

l  本試劑盒用于體外定量檢測大鼠血清,、血漿,、組織,、細胞上清及相關(guān)液體樣本中8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。

l  有效期：6個月

l  保存條件：2-8℃

實驗原理

   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平,。用純化的大鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG),，再與HRP標記的8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中大鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)濃度,。

試劑盒組成

樣本處理及要求

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心,。

2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實行,。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔,，在*,、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液50μl,，混勻；然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五,、第六孔中,，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,，混勻后從第七,、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為3600 pg/ml,， 2400 pg/ml，1200 pg/ml,，600 pg/ml,， 300 pg/ml）。

	5400 pg/ml

1. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。
2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
3. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。
4. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。
5. 加酶：每孔加入酶標試劑50ul，空白孔除外,。
6. 溫育：操作同3,。
7. 洗滌：操作同5。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,，再加入顯色劑B50ul,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
9. 終止：每孔加終止液50ul,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
10. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

注意事項

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存,。

2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果,。

3.各步加樣均應使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差,。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4.請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5.封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。

6.底物請避光保存。

7.嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8.所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9.本試劑不同批號組分不得混用,。

10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準。

計算

以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標,，   

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD     

值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋     

倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標     

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋     

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。                        

（此圖僅供參考）

試劑盒性能

1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上,。

2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和15%

檢測范圍：                                              

80 pg/ml -4000 pg/ml