介紹
多能性干細(xì)胞(PSCs)是基礎(chǔ)研究和應(yīng)用的基本工
具，包括再生治療,、藥物開發(fā)和毒理學(xué)評估,。盡管
無滋養(yǎng)層系統(tǒng)的問世大大提升了PSCs的可擴展性,，
但細(xì)胞團塊傳代技術(shù)(如使用分散酶、膠原酶或EDTA
等試劑)通常不適用于下游實驗應(yīng)用,，如高通量篩
選,、基因編輯和定向分化。
單細(xì)胞培養(yǎng)是干細(xì)胞培養(yǎng)研究中的標(biāo)準(zhǔn)和慣常方
法,。通過利用單細(xì)胞解離傳代技術(shù),，科學(xué)家們能夠
獲得值得信賴的細(xì)胞用于下游應(yīng)用和克隆篩選、成
像和細(xì)胞分選比較,，也可用于對細(xì)胞復(fù)蘇和細(xì)胞數(shù)
量要求很高的懸浮培養(yǎng),。Gibco
?
 RevitaCell?添加劑
可與Essential 8?培養(yǎng)基結(jié)合使用，用于單細(xì)胞傳
代時可實現(xiàn)zui大的細(xì)胞存活率,。與其他商品化的配
方不同,，RevitaCell?添加劑包括rho相關(guān)蛋白激酶
(ROCK)抑制劑，其選擇性優(yōu)于傳統(tǒng)的ROCK抑制劑
(如Y-27632和thiazovivin),，可與包含抗氧化劑和具
有自由基清除劑特性的分子結(jié)合使用,。這種混合物
可以zui大程度地降低單細(xì)胞傳代的影響,，大大提升
細(xì)胞總存活率,，有助于確保提升下游實驗中細(xì)胞供
應(yīng)的穩(wěn)定性和存活率,。
材料與方法
PSC培養(yǎng)和擴增
在無滋養(yǎng)層條件下,，使用Essential 8?培養(yǎng)基在玻
連蛋白(VTN-N)包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)H9人胚胎干細(xì)
胞(hESCs)和人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(使用episomal附
著體載體生成的hiPSCs),。每3至5天傳代hiPSCs一
次 ,，達(dá)到~80%匯合)。
使用TrypLE? Select酶或StemPro
?
 Accutase
?
細(xì)胞
消化液進行hiPSCs單細(xì)胞傳代
對于單細(xì)胞傳代實驗(參考圖1中的工作流程)，使
用不含鈣和鎂的DPBS沖洗細(xì)胞,，然后使用預(yù)熱的
TrypLE? Select酶(1 mL每6孔板的一個孔)進行處
理,。將細(xì)胞置于37°C,、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5分
鐘,。孵育后，使用Pipetman
?
 P1000吹吸細(xì)胞5至10
次,，以獲得單個細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至
含有3 mL新鮮Essential 8?培養(yǎng)基的錐形管內(nèi),，稀
釋消化液，以200 x g離心4分鐘,。吸棄培養(yǎng)基，小
心不要攪動細(xì)胞沉淀,，在添加了1X RevitaCell?添
加劑的Essential 8?培養(yǎng)基中復(fù)蘇并培養(yǎng)(細(xì)胞接種
密度如圖1所示)分種后18-24小時細(xì)胞,，然后每天僅
補充Essential 8?培養(yǎng)基進行培養(yǎng)