ELISA的原理及類型
1. ELISA的原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,,又保留酶的活性,。在測定時,,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開,。再加入酶標記的抗原或抗體,,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后,,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),,故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,,使測定方法達到很高的敏感度,。
2. ELISA的類型
ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體,。在這種測定方法中有三個必要的試劑:(1)固相的抗菌素原或抗體,,即"免疫吸附劑"(immunosorbent);(2)酶標記的抗原或抗體,,稱為"結(jié)合物"(conjugate),;(3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法,。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型:
2.2.1 雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),,形成固相抗體,。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2) 加受檢標本,,保溫反應(yīng),。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物?! ∠礈斐テ渌唇Y(jié)合物質(zhì),。
3) 加酶標抗體,保溫反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合 的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān),。
4) 加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,,測知標本中抗原的量,。 在臨床檢驗中,,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,,例如HBsAg、HBeAg,、AFP,、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法,。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物,。如應(yīng)用單克隆抗體,,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測,。
在一步法測定中,當(dāng)標本中受檢抗原的含量很高時,,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合,,而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,,此時反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2,,圖1-4),如按常法測讀,,所得結(jié)果將低于實際的含量,,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應(yīng)嚴重時,,反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,,應(yīng)注意可測范圍的zui高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,,例如HBsAg的a決定簇,,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題,,HBsAg有adr,、adw、ayr,、ayw4個亞型,,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題,。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾,。RF是一種自身抗體,多為IgM型,,能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合,。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,,同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合,,表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,,由于去除了Fc段,,從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,,已被列為這類試劑的一項考核指標(參見6.2),。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,,因其不能形成兩位點夾心,。
2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物,,以檢測相應(yīng)的抗體,。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋,,可直接用于測定,,因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備,,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,,尋找合適的標記方法。
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