ELISA的原理及類型

1.　ELISA的原理

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性,。在測定時(shí),，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度,。

　　2.　ELISA的類型

　　ELISA可用于測定抗原,，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體,，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）,；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）,；（3）酶反應(yīng)的底物,。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法,。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：

　　2.2.1　雙抗體夾心法測抗原

　　雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：

　　1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體,。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。

　　2） 加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng),。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物?！　∠礈斐テ渌唇Y(jié)合物質(zhì),。

　　3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合　　的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān),。

　　4） 加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,，測知標(biāo)本中抗原的量,。　　在臨床檢驗(yàn)中,，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,，例如HBsAg、HBeAg,、AFP,、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法,。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動物,。如應(yīng)用單克隆抗體,，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測,。

　　在一步法測定中,，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,，而不再形成"夾心復(fù)合物",。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4）,，如按常法測讀,，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect）,，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg,、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測范圍的zui高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng),。

　　假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇,，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物,。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBsAg有adr,、adw,、ayr、ayw4個亞型,，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。

　　雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾,。RF是一種自身抗體,，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合,。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF,，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng),。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段,，從而消除RF的干擾,。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)（參見6.2）,。

　　雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心,。

　　2.2.2 雙抗原夾心法測抗體

　　反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體,。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法,。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,，尋找合適的標(biāo)記方法。