蛋白質(zhì)的分離純化有多類方法，如沉淀法（特別常用鹽析法,、等電點沉淀法,、有機溶劑沉淀法）、膜分離法（超濾法,、透析法）,、色譜法、離心分離法等,。每類方法有其自己的特點和適用范圍,。如粗提常用沉淀法，精提就不會用沉淀法,。這些方法中,，應(yīng)用zui廣的是色譜法。
色譜法,，在生化和醫(yī)藥行業(yè)叫層析,。但中國化學(xué)會、中科院相關(guān)部門及有關(guān)期刊都規(guī)定要叫色譜,。在國家有關(guān)色譜名詞術(shù)語的國家標準中 “chromatography ” 一詞翻譯成 “ 色譜 ” ,。故在此我們將柱分離叫色譜。柱內(nèi)的分離介質(zhì)一般也叫填料,、固定相,。

在蛋白質(zhì)色譜純化中zui重要的是分離介質(zhì)和色譜條件的選擇。有些從事分離工作的人,，拿到樣品后常不知道怎么辦,。其實這兩者的選擇只要根據(jù)分離對象和每種色譜的分離機理來考慮,，就可以自行設(shè)計分離方案,。蛋白質(zhì)分離介質(zhì)的選擇應(yīng)從蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)入手考慮。

與一般小分子的天然產(chǎn)物和合成化合物的分離純化工作比起來,，蛋白質(zhì)的分離有許多特殊性,。

1. 蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定了其分離工作的方法選擇。

蛋白質(zhì)分子量大,，都在 6KD 以上,，是由多個氨基酸按一定序列通過肽鍵組合成肽鏈，再由一個或多個肽鏈通過共價鍵和非共價鍵組合成有復(fù)雜三級、四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子,。蛋白質(zhì)還可能與糖,、脂及核酸結(jié)合得到結(jié)合蛋白,，不同的結(jié)合蛋白在性質(zhì)上會有差異,。蛋白質(zhì)的外形為球狀和纖維狀，其大小因其分子量不同差異很大,。故可以用排阻色譜,、超濾和膜法分離大小不同的蛋白質(zhì),。

蛋白質(zhì)與氨基酸一樣,，會兩性離解,，在不同的 pH 下形成正離子或負離子，蛋白質(zhì)也有等電點,。在相同的 pH 下,，不同的蛋白質(zhì)表面帶電情況不一樣，故可以用離子交換色譜分離蛋白質(zhì),。

蛋白質(zhì)的氨基酸殘基會有一些苯基,、烷基等疏水性基團，這些疏水側(cè)鏈在水相中會盡可能避開水相而藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,，形成蛋白質(zhì)分子外部親水性基團多,，疏水性基團多在蛋白質(zhì)裂隙內(nèi)部的情況，在不同條件下蛋白質(zhì)裂隙會有不同的伸展而暴露出內(nèi)部的疏水基團,。在同一個介質(zhì)中,，不同蛋白質(zhì)表面的疏水性不同,，可以用疏水相互作用色譜和反相色譜分離。

生物大分子有一個特性,，某些分子或基團對它們有特異性很強的吸附作用,。這種作用只針對一種或一類目標物質(zhì),。如抗體特異性吸附抗原,，苯甲脒對含絲氨酸的蛋白質(zhì)有吸附作用。這就是親和色譜的應(yīng)用原理, 一般的小分子是不會有這種特異性吸附作用的,。

2. 要特別注意保持樣品的生物活性,。

蛋白質(zhì)有復(fù)雜的三級,、四級結(jié)構(gòu),，熱,、光和化學(xué)品會導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生理活性喪失，這叫失活,。失活有可逆和不可逆兩種,。不可逆失活的蛋白質(zhì)常是固體,，不溶于水和溶劑,，不再具有蛋白質(zhì)原有的生理性質(zhì),?？赡媸Щ畹牡鞍踪|(zhì)可用不同的復(fù)性方法恢復(fù)其原有的生理活性。

蛋白質(zhì)在選擇和評價分離純化的方法,、介質(zhì)和色譜條件時,，不僅要注意樣品的質(zhì)量回收率，還特別要重視活性回收率,。要保持樣品的生物活性,，在分離方法,、填料,、色譜條件和操作工藝上要注意,。

在排阻,、離子交換、疏水和反相,、親和四類色譜中,，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性,、定量分析和氨基酸序列分析,，不太用于制備；其他的色譜方法,，只要條件選擇合適,，都可以得到高的活性回收率。

3. 使用的色譜介質(zhì)要注意其合適的分子量適用范圍,。

一般的介質(zhì)都是多孔的,，多孔介質(zhì)的比表面有 90%~95% 是在孔內(nèi)。分離時充分利用孔內(nèi)表面,，柱容量才能大,。所以要根據(jù)樣品分子量選擇具有合適的孔的介質(zhì),。在排阻色譜中孔的大小用排阻極限表示；其他色譜用分子量適用范圍表示,，實際是其基質(zhì)的排阻極限,。

常用的蛋白質(zhì)分離介質(zhì)是瓊脂糖和葡聚糖系列。瓊脂糖的分子量適用范圍取決于制備時瓊脂糖的濃度,，大家熟悉的 4B ,，糖的濃度是 4% ，適用 6 ×10 4 ~2 × 10 7 分子量,； 6B ,，糖的濃度是 6% ，適用 1 × 10 4 ~4 × 10 6 分子量,。葡聚糖系列的分離范圍要看產(chǎn)品說明書,，從幾千到上千萬不等。

常用的硅膠系列孔徑有用于小分子的 6~12nm ,；有用于一定分子量蛋白質(zhì)的 30 ,、 50 、 100nm ,。

4. 生物大分子有不同于小分子的色譜特性,。

包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物大分子有一些特別的色譜性質(zhì)。

在梯度洗脫的色譜,，如反相色譜,、疏水色譜、離子交換中,，強洗脫劑的濃度對保留值（容量因子）作圖有明顯的突躍,。而有機小分子沒有此突躍。在蛋白質(zhì)分離的許多問題可由此得到解釋,。

5 ．紫外檢測器檢測波長固定在 280nm 和 220nm ,。

280nm 是檢測蛋白質(zhì)中的苯基， 220nm 是檢測肽鍵,。蛋白質(zhì)檢測實際常在選用 280nm 檢測波長,。
蛋白質(zhì)分離介質(zhì)選擇要同時考慮兩方面，一是配基,，也就是選擇色譜模式,；二是選擇基質(zhì)，包括基質(zhì)的種類和排阻極限的選擇,。
根據(jù)目標產(chǎn)品與雜質(zhì)的性質(zhì)差異選擇介質(zhì)是介質(zhì)選擇的主要依據(jù),。選擇了介質(zhì)也就是選擇了分離模式。

目標產(chǎn)品與雜質(zhì)在分子大小,、等電點 pI,、不失活或可逆失活條件下的疏水性,、與親和配基的作用四種性質(zhì)上的差異是介質(zhì)選擇的主要依據(jù)之一。產(chǎn)品與雜質(zhì)某方面的性質(zhì)有大的差異,，就可用來做為分離方法選擇的依據(jù),。目標產(chǎn)品與雜質(zhì)分子大小差異大可用凝膠色譜分離,；等電點pI 差異大可用離子交換色譜分離,；不失活或可逆失活條件下的疏水性差異大可用疏水色譜分離；與某個親和配基有特異作用的可用親和色譜分離,。

在凝膠色譜,、離子交換、疏水和反相,、親和類色譜中,，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性,、定量分析和氨基酸序列分析,，不太用于制備；其他的色譜方法,，只要條件選擇合適,，都可以得到高的活性回收率，可以用于制備分離,。

基質(zhì)主要有 3 大類：聚多糖,，如交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖基質(zhì),；硅膠和多孔玻璃,；有機聚合物（聚苯乙烯等）。

由于目標產(chǎn)品限定在蛋白質(zhì),，分子量比較大,，用于小分子的小孔填料肯定不能用。因為,，多孔填料的總的表面積,，有 90~95%是在孔內(nèi)，球型填料的球面上的面積只占有 5~10% ,。小孔填料的柱容量太小,。

大孔硅膠和多孔玻璃，與蛋白質(zhì)生物相容性差,，大孔硅膠價格貴,，表面活性基團少，制備的填料會殘留酸性的硅羥基,，造成非特異性吸附,。大孔有機聚合物疏水性強,，與蛋白質(zhì)生物相容性太差，不作親水性處理無法用于蛋白質(zhì)分離,。

交聯(lián)瓊脂糖,、葡聚糖基質(zhì)是用于蛋白質(zhì)分離的基質(zhì)材料，這兩類材料生物相容性好,，無非特異性吸附,，表面有大量羥基，可用于連接配基,，制得各種填料,。

瓊脂糖微球及其交聯(lián)后的產(chǎn)品一般叫 4B 、 CL4B ,、 4FF ,、 6B 、 CL6B ,、 6FF,，這些產(chǎn)品再鍵合上不同基團得到離子交換、疏水,、親和色譜填料,。 4B 、 CL4B ,、 4FF 制備時的糖濃度為 4% ,，排阻極限為 6 萬~2000 萬。 6B ,、 CL6B ,、 6FF 制備時的糖濃度為 6% ，排阻極限為 1 萬 ~400 萬,。 4B ,、 6B 耐壓低；CL4B ,、 CL6B 耐壓稍高一點,，仍很低； 4FF ,、 6FF 耐壓較高,，使用壓力可到 0.15 或 0.3MPa 。

葡聚糖是線形結(jié)構(gòu),，用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)成球,。因糖濃度和交聯(lián)度不同，得到不同排阻極限的微球。葡聚糖微球排阻極限范圍小些,，在使用時不同條件下柱體積會有較大的變化,，已逐漸較少用于離子交換、疏水,、親和色譜,，較多用于凝膠色譜。
西安恒成生物科技有限公司是一家專業(yè)從事層析介質(zhì)（色譜填料）研產(chǎn)銷一體的公司,；
有兩大類產(chǎn)品：無配基微球和層析介質(zhì)
五大層析介質(zhì)都有：離子交換,，排阻（凝膠過濾），親和,，疏水,，反向,；
三類材料：瓊脂糖凝膠,，葡聚糖凝膠，硅膠
離子交換包括：陽離子（SP,，CM)陰離子（Q,DEAE);
凝膠過濾包括：4B,6B,CL-4B,CL-6B,4BFF,6BFF
疏水包括：苯基,，丁基
親和的有：蛋白a柱，去內(nèi)毒素柱,，肝素柱,，明膠柱，賴氨酸柱,，硼酸柱,，ConA柱，鎳柱等,。
親和活化中間體有：溴化*活化4B,，氨已基4B，羧已基4B,，環(huán)氧活化FF,NHS活化等,；
反向的有C18，C8,，C12