實(shí)驗(yàn)方法原理    先用組織學(xué)完整的新鮮人肝癌組織接種于裸鼠皮下,，形成皮下移植瘤,，然后用此移植瘤組織再接種于裸鼠肝內(nèi),，建立肝原位移植瘤模型（間接肝原位移植瘤模型）,，并將其與直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔內(nèi)移植瘤模型作比較,。
實(shí)驗(yàn)材料    NC裸鼠Balb c裸鼠
試劑,、試劑盒    肝癌外科手術(shù)切除標(biāo)本Hanks液戊*鈉甲醛石蠟
儀器、耗材    針頭光學(xué)顯微鏡手術(shù)刀剪刀紗布消毒液口罩
實(shí)驗(yàn)步驟    
一,、間接肝原位移植瘤模型的制備

1.  用新鮮的肝癌外科手術(shù)切除標(biāo)本（來(lái)自長(zhǎng)海醫(yī)院,，患者為1名47歲男性，病理診斷：肝左葉肝細(xì)胞癌,，粗梁型,，Ⅱ級(jí)），在Hanks液中,，去除壞死組織和非癌組織后切成1～2 mm3小塊,。

2.  取2塊瘤組織，在離體40 min內(nèi)用粗針頭植入裸鼠腰背部皮下,，待皮下移植瘤長(zhǎng)到直徑約1 cm時(shí)切取腫瘤,，在Hanks液中，去除壞死組織后切成1～2 mm3小塊,，裸鼠用戊*鈉腹腔麻醉后,，行左上腹橫切口，暴露肝臟,。

3.  取上述2塊瘤組織,，在離體40 min內(nèi)用粗針頭植入裸鼠肝右葉深部實(shí)質(zhì)內(nèi)，全層關(guān)腹,。
 
二,、直接肝原位移植瘤模型的制備

1.  同一例新鮮肝癌手術(shù)切除標(biāo)本，處理方法同皮下移植,，裸鼠處理同間接肝原位移植,，取2塊瘤組織，在離體40 min內(nèi)用粗針頭直接植入裸鼠肝右葉深部實(shí)質(zhì)內(nèi),。
 
2.  皮下移植瘤模型和腹腔內(nèi)移植瘤模型的制備,。
 
三,、病理檢查和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)
 
1.  解剖和組織學(xué)檢查

（1）所有裸鼠接種后，分組分籠飼養(yǎng),，自由進(jìn)食,，每天觀察1～2次。

（2）當(dāng)裸鼠處于全身衰竭狀態(tài)時(shí)處死并作大體解剖,，對(duì)接種瘤和轉(zhuǎn)移瘤分別進(jìn)行觀察,、測(cè)量，記錄腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移情況,，重要器官（主要為肝和肺）經(jīng)10%中性甲醛固定后,，常規(guī)石蠟制片，光學(xué)顯微鏡檢查,。
 
2.  周圍血甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)

處死前,，均采用摘眼球采血的方法獲得血液，用生化法檢測(cè)AFP的分泌量,。

3.  瘤細(xì)胞DNA含量分析

留取部分移植瘤標(biāo)本采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量分析,。
 
收起 
其他    
一、實(shí)驗(yàn)討論 

目前,，肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是其術(shù)后長(zhǎng)期存活的主要障礙,。為了研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，建立接近于人體的腫瘤動(dòng)物模型顯得尤為重要,。早期建立的動(dòng)物移植瘤模型,，移植瘤雖能維持來(lái)源腫瘤的組織結(jié)構(gòu)和生化特性，但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移,，從而影響了它在研究人類腫瘤轉(zhuǎn)移特性方面的價(jià)值,。進(jìn)一步研究表明，人癌在宿主體內(nèi)表達(dá)侵襲轉(zhuǎn)移能力,，不但需要具備合適的移植環(huán)境,，而且還依賴于瘤細(xì)胞之間、瘤細(xì)胞與宿主之間的相互作用,。

近年來(lái),，根據(jù)原位移植理論建立起來(lái)的人癌瘤原位移植模型克服了這一缺陷，它不僅維持了原有瘤組織的結(jié)構(gòu),，而且還保持了人體瘤的絕大部分生物學(xué)特性,，特別是轉(zhuǎn)移特性，它在宿主體內(nèi)能以類似于患者體內(nèi)的方式顯示其惡性行為,。在這一新型模型的啟發(fā)下,，人們相繼陸續(xù)建立了人類多種癌瘤的裸鼠原位移植瘤模型，為人類更好地研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了理想的工具。

Sun等采用組織學(xué)完整的患者肝癌標(biāo)本,，在裸鼠體內(nèi)建立了人肝癌原位移植瘤模型LCI-D20,，該模型具有很高的自發(fā)轉(zhuǎn)移率，與裸鼠皮下移植瘤模型相比,，雖然其組織學(xué)特征相似,，但兩者的轉(zhuǎn)移能力卻是截然不同的，肝內(nèi)原位移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移率達(dá)100％,，而皮下移植瘤卻罕見(jiàn)有轉(zhuǎn)移,。LCL-D20*不足在于移植瘤存活率低（1/16）。

Yamada 等用來(lái)自人肝膽管細(xì)胞癌細(xì)胞株接種裸鼠皮下形成皮下移植瘤和通過(guò)脾血管注射形成肝移植瘤,，研究亦發(fā)現(xiàn)肝移植瘤轉(zhuǎn)移率明顯高于皮下移植瘤（100% vs 20%）,。

Kimura等和Kuo 等研究后亦得出了類似的結(jié)論,。我們參照上述實(shí)驗(yàn)方法,，并加以改進(jìn)，先建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,，然后再接種裸鼠肝內(nèi)建立原位移植模型,，其原理是先讓人肝癌組織在裸鼠皮下適應(yīng)裸鼠體內(nèi)環(huán)境，然后再接種于肝臟,，從而保證了移植瘤的存活率,。研究表明，該模型與直接肝原位移植瘤模型一樣能充分展示人肝癌的生物學(xué)特性,，與裸鼠皮下和腹腔移植瘤相比,，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力均優(yōu)于后者。

為了探討原位與皮下移植腫瘤在腫瘤生物學(xué)行為上產(chǎn)生差異的機(jī)制,，可以對(duì)原位與皮下移植瘤分別進(jìn)行p53等癌基因表達(dá)和多種化療藥物治療研究,，發(fā)現(xiàn)原位移植瘤p53表達(dá)的強(qiáng)度明顯高于皮下移植瘤，且兩者對(duì)多種化療藥物的敏感性亦是不同的,。造成這種差異的原因可能在于腫瘤所處的微環(huán)境不同,，從而影響了其生物學(xué)特性的發(fā)揮。

Fukumura 等通過(guò)對(duì)裸鼠皮下和肝內(nèi)結(jié)腸癌移植瘤的實(shí)驗(yàn)后得出肝微環(huán)境對(duì)結(jié)腸癌移植瘤的血管形成和微循環(huán)建立的影響與皮下微環(huán)境對(duì)移植瘤的影響是不同的,。

Cui 等指出,，腫瘤的局部侵襲是發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提，只有具備局部侵襲能力的腫瘤才能有轉(zhuǎn)移的能力,。皮下和腹腔內(nèi)種植的腫瘤由于受所處部位微環(huán)境的“不良”影響,，往往在腫瘤周圍形成纖維包膜，從而限制了腫瘤侵襲周圍組織,、淋巴管,、血管的能力，所以轉(zhuǎn)移的機(jī)率就大為減少了，而原位移植部位本身就是腫瘤生長(zhǎng)的“土壤”,，在這里腫瘤獲得了充分的“滋潤(rùn)”,，腫瘤無(wú)包膜形成，因而能充分展示其生物學(xué)特性,。說(shuō)明要表達(dá)完整的轉(zhuǎn)移模式必須具備較好的植入環(huán)境,，只有原位移植模型才能完整表達(dá)人類癌瘤的轉(zhuǎn)移特性。
 
移植瘤與原患者肝癌組織之間的形態(tài)學(xué)上的差異,，可以認(rèn)為移植的腫瘤組織其形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)只能反映取材部位瘤源的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),。此外，移植瘤組織中適應(yīng)裸鼠體內(nèi)環(huán)境的,、生長(zhǎng)力強(qiáng)的細(xì)胞群體,，可獲得優(yōu)勢(shì)，而弱的則在傳代過(guò)程中丟失,。晚期,，移植瘤由于宿主血供難以維持其生長(zhǎng)需要，腫瘤發(fā)生壞死,、出血,，宿主也因衰竭而死亡。