一,、勻漿介質

一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境,。

二,、細胞樣本的前處理:

1,、細胞沉淀的收集：

① 懸浮細胞: 對于懸浮培養(yǎng)的細胞，直接通過離心收集細胞沉淀,，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,，棄上清留細胞沉淀。

② 貼壁細胞: 對于貼壁培養(yǎng)的細胞,，用胰酶將細胞消化下來,，或用細胞刮將細胞刮下來，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,，棄上清留細胞沉淀,。

我們一般建議客戶,，細胞密度不要小于一百萬個/ml。

2,、細胞沉淀的洗滌：

在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS （等滲）,， 輕輕顛倒混勻，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,，棄上清留細胞沉淀,。

重復上述操作反復洗滌1～2次。

3,、勻漿的方式：手工勻漿,，超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。

① 手工勻漿：在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變,，一般加入0.5ml,，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻,，將細胞懸浮于PBS中,，用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,，手動勻漿3分鐘,，然后取破碎好的細胞懸浮液進行測定。

② 超聲破碎:

在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變,，一般加入0.5ml,，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻,，將細胞懸浮于PBS中,，在冰水浴條件下進行如下操作:

     a、用超聲粉碎機進行粉碎,，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,，也可用國產超聲波發(fā)生儀，用400安培,，5秒/次,，間隙10秒反復3～5次。

      b,、用超聲細胞破碎儀,，300W功率，每次超聲3～5秒,，間隔30秒,，重復4～5次。

③ 裂解液裂解 

常用裂解液有SDS,、NP-40,、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,，或者說作用力量強弱不同。

1,、SDS屬于離子型去垢劑,，zui厲害，基本可以把細胞*破掉,，DNA會釋放出來,，裂解液變得很粘稠。

2,、NP-40是很溫和的去垢劑,，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱,，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白,。

3,、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分之一,，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會使蛋白變性失活）,。

去垢劑屬性只是一方面，buffer,、配比,、濃度、提取方法和材料處理也都是關鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進行裂解,。

④ 反復凍融:

在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變,，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml）,，混勻,，將細胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結冰,，溶解,，再結冰，再溶解,，反復3次左右）,。

                由于反復凍融對酶活力影響較大,一般不推薦使用

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