實(shí)驗(yàn)方法原理    ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原,、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性,。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì),，具體的方法步驟可有多種,。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法,。

實(shí)驗(yàn)材料    BSA血清
試劑、試劑盒    碳酸鹽緩沖液PBS蒸餾水磷酸棗檸檬酸四甲基聯(lián)苯胺
儀器,、耗材    塑料板ELISA檢測(cè)儀加樣器 滴頭毛巾洗滌瓶燒杯玻璃棒試管吸管量筒冰箱孵育箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
一,、用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法

1.  包被

用0.05 M PH9 牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 ml,，4 ℃,。次日，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖 液洗3次,，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌,，下同）,。

2.  加樣

加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 小時(shí),。 然后洗滌,。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）,。

3.  加酶標(biāo)抗體

于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度） 0.1 ml,。37 ℃孵育0.5～1 小時(shí)，洗滌,。

4.  加底物液顯色

于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml,，37 ℃10～30 分 鐘。

5.  終止反應(yīng)

于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 ml,。 

6.  結(jié)果判定

（1）可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果。

反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程 度越強(qiáng),，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”,、“-”號(hào)表示。

（2）可測(cè) OD值

在ELISA檢測(cè)儀上,，于450 nm（若以ABTS顯色,，則410 nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后 測(cè)各孔OD值,，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,，即為陽性。

二,、用于檢測(cè)未知抗體的間接法 

1.  用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/ml,， 每孔加0.1 ml,，4 ℃,。次日洗滌3 次。

2.  加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔 中,，置37 ℃孵育1小時(shí),，洗滌。（同時(shí)做空白,、陰性及陽性孔對(duì)照）

3.  于反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗體）0.1 ml， 37 ℃孵育30-60 分鐘,，洗滌,，zui后一遍用DDW洗滌。

4.  其余步驟同“雙抗體夾心法”的4,、5,、6。

收起 
注意事項(xiàng)    
1.  正式試驗(yàn)時(shí),，應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,，待檢樣品應(yīng)作一式二份,，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,，說明有非特異性反應(yīng),，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉,。

2.  在ELISA中,，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括

（1）固相載體的選擇

許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯,、聚苯乙烯、聚丙酰胺 和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板,、試管、珠粒等,。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔 板,。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被,，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反 應(yīng),，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。

（2）包被抗體（或抗原）的選擇

將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí),，要求純度要 好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度,，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采 用4 ℃18～24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1,、1.0和 10 μg/ml等）進(jìn)行包被后,，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值,。選擇OD值z(mì)ui 大而蛋白量zui少的濃度,。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10 μg/ml。

（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇

首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定 ,。然后再固定其它條件或采取“方陣法“（包被物,、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記 抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4）酶的底物及供氫體的選擇

對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉,、安全,、有明顯地顯色反 應(yīng)，而本身無色,。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護(hù),。有條件者應(yīng)使 用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時(shí) 間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時(shí)間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液 必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。