實(shí)驗(yàn)方法原理    將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體,，識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清等標(biāo)本中Tac并與之結(jié)合。應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識(shí)別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合,。通過(guò)酶催化底物顯色反映待檢標(biāo)本中游離Tac的水平,。
實(shí)驗(yàn)材料    抗體PHA
試劑,、試劑盒    緩沖液洗滌液稀釋液終止液
儀器、耗材    塑料板檢測(cè)儀水浴箱冰箱CO2孵箱加樣器
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

取外周血10 ml,，肝素抗凝,，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，加至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,，2×106 /孔,，RPMI1640-10％ FCS＋PHA 3 μg/ml，Wellcome公司,，37 ℃,、5 ％CO2培養(yǎng)72 小時(shí)，收集上清,，-20 ℃保存待測(cè),。同時(shí)設(shè)未加PHA對(duì)照組?？蛇x用病人血清為待測(cè)標(biāo)本,。

2.  Ab1包被

用0.05 M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體（Ab1）稀釋 至5 μg/ml，加至ELISA板,，100 μl/孔,，4 ℃包被72 小時(shí)。

3.  封閉

1 ％BSA-PBS封閉,，350 μl/孔,，37 ℃孵育2小時(shí)。

4.  加樣

ELISA板用PBS-T洗液洗3次,，PHA刺激單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照 組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024,，每一稀釋度取100 μl加至ELISA板。HUT- 102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清為陽(yáng)性對(duì)照,，RPMI1640-10％FCS培養(yǎng)液為陰性對(duì)照,。37 ℃，孵育 2 小時(shí)，洗滌,。

5.  加酶標(biāo)抗體

于各反應(yīng)孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記另一種抗 Tac 特異性單克隆 抗體Ab2以效價(jià)滴定的*稀釋度稀釋100 μl,。37 ℃孵育2小時(shí),，洗滌,。

6.  加底物顯色

各反應(yīng)孔加新鮮配制ABTS底物溶液100 μl，37 ℃,，孵育15 分 鐘,。

7.  終止反應(yīng)

各反應(yīng)孔加2 ％氟化鈉終止液50 μl。

8.  結(jié)果判定

首先肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色,，稀釋梯度是否均勻,。陽(yáng)性、u性結(jié) 果是否明顯,。然后于ELISA檢測(cè)儀上測(cè)各孔OD值（410 nm）,。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  包被抗體活性要較高，否則影響本實(shí)驗(yàn)敏感性,。

2.  經(jīng)篩選比較,，封閉液以1 ％BSA-PBS為好。

3.  酶標(biāo)結(jié)合物應(yīng)用前應(yīng)進(jìn)行效價(jià)滴定,，選擇*工作濃度,。

4.  底物應(yīng)選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。

5.  如有條件,，酶標(biāo)McAb可由生物素-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替,，以增加實(shí) 驗(yàn)的敏感性。