一,、ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性。在測定時(shí),，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開,。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度,。

二,、ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體,。在這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體,，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體,，稱為"結(jié)合物"（conjugate）,；（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件,，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法,。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：

1.雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體,。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加受檢標(biāo)本,，保溫反應(yīng),。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì),。

3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān),。

4）加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,，測知標(biāo)本中抗原的量,。

在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg,、HBeAg,、AFP、hCG等,。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物,。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對抗原上不同決定簇的單抗,，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),，作一步檢測,。在一步法測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,，而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同,，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hookeffect）,，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí),，應(yīng)注意可測范圍的zui高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇,，例如HBsAg的a決定簇,，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題,，HBs Ag有adr,、adw、ayr,、ayw4個(gè)亞型,，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（ RF）的干擾,。RF是一種自身抗體,，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合,。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有R F,，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng),。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,，由于去除了Fc段,，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo),。雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原,，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心,。

2.雙抗原夾心法測抗體

反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,，以檢測相應(yīng)的抗體,。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,，可直接用于測定,，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法,。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法,。

3.間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法,。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）,。操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。

2）加稀釋的受檢血清,，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去,。

3）加酶標(biāo)抗抗體,。可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測總抗體,，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體,。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后,，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4）加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷,。

間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法,。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,，但應(yīng)盡可能予以純化,，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì),，例如以 E.Coli為工程酶的重組抗原,，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng),?？乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原,，如不將其中的Ig去除,，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白,，也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?。間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分,。IgG的吸附性很強(qiáng),，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面,。因此在間接法中,，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙,。另外,，在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷,。

4.競爭法測抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,，或不易得到足夠的純化抗原時(shí),，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合,。標(biāo)本中抗體量越多,，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng),。如抗原為高純度的,，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì),，直接包被不易成功,，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,，然后加入抗原,，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì),，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng),。競爭法測抗體有多種模式,，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合,，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合,，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采用此法,。

5.競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定,，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合,。標(biāo)本中抗原量含量愈多,，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，zui后的顯色也愈淺,。小分子激素,、藥物等ELISA測定多用此法。

6.捕獲包被法測抗體

IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中,。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體,。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體,，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上,。因此如用抗人IgM作為二抗,，間接測定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,，以除去IgG的干擾,。在臨床檢驗(yàn)中測定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相,，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）,。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合,。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體,。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān),。此法常用于病毒性的感染的早期診斷,。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體,，導(dǎo)致假陽性反應(yīng),。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功,。

7.ABS-ELISA法

ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語,。親和素是一種糖蛋白，分子量60000,，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成,。生物素為小分子化合物，分子量244,。用化學(xué)方法制成的衍生物素- 羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物,，標(biāo)記方法頗為簡便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性,，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多,，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與 4個(gè)生物素分子結(jié)合,，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型,。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在LAB 中,，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng),，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期,，親和素從蛋清中提取,，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng),，用于ELISA中可使本底增高,。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點(diǎn),，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑,，增加了操作步驟,，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。