第九章 蛋白顯色

    酶促反應(yīng)比同位素安全且快速,，已經(jīng)成為 Western Blot 的主流檢測方法,。酶促反應(yīng)可以搭配不同的底物從而實(shí)現(xiàn)不同的顯色方法：化學(xué)發(fā)光和底物顯色，前者靈敏度很高,，已經(jīng)達(dá)到皮克級別,，甚至還有飛克級別的,，靈敏度超過了同位素,；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。

    大家zui為熟悉熟悉當(dāng)數(shù)辣根過氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶 AP（AlkalinePhosphatase）,，此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）和 β 半乳糖苷酶（β-Galactosidase）,。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物 5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物,；而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物,，將 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?/span> 4-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法,，辣根過氧化物酶在H2O2存在下,，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光,，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大 1000 倍,，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。

① HRP 標(biāo)記二抗用 DAB 顯色,，按順序依次將 DAB 三種劑各取 3 滴于 5 ml 蒸餾水中,，避光混勻,，將膜加入顯色液中避光顯色 5-15min 終止反應(yīng)，對照 Marker 記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，將 NC 膜晾干掃描保存,。HRP的生色底物顯色有 DAB、4-CN,、CN/DAB,、AEC 和 TMB 等。

     HRP 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物主要有 Luminol,、ECL 和 SuperSignal 系列,。可直接從公司購買試劑盒,，操作比較簡單,，原理如下（二抗用 HRP 標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到 HRP,，即發(fā)光,，可使膠片曝光，就可洗出條帶,。

② AP顯色底物生成的產(chǎn)物主要是藍(lán)紫色,，成像性好容易拍照。 AP的底物顯然更穩(wěn)定,，不像HRP那樣需要新鮮 配制 的 H2O2一 類 的不穩(wěn) 定成 分,，作 為試 劑盒可 以保 存時(shí)間 更長 。常用顯 色底物 的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 ’ -Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ,， NBT (Nitro-Blue TetrazoliumChloride)和INT,。

③ 底物發(fā)光法：將兩種顯色底物 1:1 等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來,，馬上在暗室中將 X 光片覆蓋在膜的上面（時(shí)間根據(jù)光的亮度來衡量）,，顯影、定影,。（注意：發(fā)光法檢測的時(shí)候曝光時(shí)間要恰到好處,，過短會導(dǎo)致曝光不*，影響條帶亮度,，過長會導(dǎo)致熒光信號衰弱,，也會使背景顏色加深）除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑,，比如：熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗（可通過紫外燈產(chǎn)生熒光）,；生物素結(jié)合的二抗等等。

關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項(xiàng)：

① 保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài),，在標(biāo)本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF,，可以防止去磷酸化）,，并將標(biāo)本時(shí)刻保持在冰浴中。

② 使用 5%的 BSA 作為封閉試劑,，不能使用脫脂奶粉（因?yàn)槊撝谭壑泻欣业鞍?，會出現(xiàn)很高的背景）。

③ 請謹(jǐn)記蛋白的磷酸化是需要誘導(dǎo)的,，當(dāng)信號低或者無信號時(shí)有可能是磷酸化誘導(dǎo)不充分,！確保使用陽性對照。