【概要】

赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物,，屬烈性的腎臟毒和肝臟毒,，廣泛存在于各種食物中。谷物及其副產(chǎn)品是赭曲霉毒素A的主要來源,。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明攝入了被這種毒素污染的飼料后,，會(huì)發(fā)生急性或慢性中毒癥。防止污染赭曲霉毒素A的食品和飼料直接或間接地進(jìn)入人類食物鏈,，加強(qiáng)對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)十分重要,。

赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑【適范圍】

可定性、定量檢測(cè)谷物,、飼料,、面粉、啤酒,、紅酒,、飲料等樣本中的赭曲霉毒素A。

赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑【試驗(yàn)原理】

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA,，在微孔板上預(yù)包被赭曲霉毒素A抗原,，加入樣本/赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的赭曲霉毒素A與預(yù)包被在微孔板上的赭曲霉毒素A抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體,。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去,，再加入顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物赭曲霉毒素A抗原的含量成負(fù)相關(guān),。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,，即可得出相應(yīng)殘留物赭曲霉毒素A的含量。

赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：1ppb

【交叉反應(yīng)率】

   結(jié)構(gòu)類似物                                           交叉反應(yīng)率

  赭曲霉毒素A   ……………………………………………………………  100%

  赭曲霉毒素B   ……………………………………………………………  43%

  赭曲霉毒素C   ……………………………………………………………  5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb

3. 酶標(biāo)物 1瓶   …………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶   …………………………………… 12ml

5. 終止液1瓶   …………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液（10×）1瓶 …………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶……………… 20ml

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

---微孔板酶標(biāo)儀450nm

---振蕩器

---粉碎機(jī)

---離心機(jī)

---微量天平

---微量移液器：?jiǎn)蔚?20μl～200μl,、200μl～1000μl,、多道 300μl

試劑：

---去離子水（或蒸餾水）

---二氯甲烷

---鹽酸

---NaHCO3

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）,。

【樣品前處理步驟】

一,、谷物與飼料（稀釋倍數(shù)：2.5）

1. 稱取1g粉碎的樣品，加入0.5ml 0.13M NaHCO3,，震蕩1min,，

2. 加入2ml樣品稀釋液，震蕩5min,；

3. 室溫下,，2000g離心15min；

4. 取100μl待測(cè),。

二,、果汁、啤酒,、飲料（稀釋倍數(shù)：1）

1. 碳酸飲料應(yīng)去除CO2（60℃水浴或振蕩去除）

2. 取2ml 樣品,，加入 1ml 1mol/L HCl 振勻，加入2ml CH2Cl2 振勻 3min,；

3. 室溫下,，3500g離心10min；

4. 去除上層液,，吸取下層1ml,加入800μl樣品稀釋液，強(qiáng)烈振蕩3min,；

5. 室溫下,，3500g離心10min；

6. 取480μl上層液,，加入120μl甲醇,，振蕩均勻，取100μl待測(cè),。

【檢測(cè)步驟】

一,、 測(cè)定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃,，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性,。。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn),。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射,，用蓋板膜封住微孔板,。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出,，放置室溫（20～25℃）30min以上,，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板,，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封,，放置于2～8℃。不可冷凍,。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫,。

4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。

5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔,，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

6. 小心揭開蓋板膜,，用洗滌工作液充分洗滌,，300μl/孔，洗板5次,，每次間隔30s,，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔,，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

8. 加終止液50μl/孔,，輕輕振蕩混勻,，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結(jié)果判定】

1. 百分吸光率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以100%,，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A實(shí)際量,。

【注意事項(xiàng)】

1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。

2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻,。

4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸,，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒,；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒,；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6. 儲(chǔ)存條件：

試劑盒保存于2～8℃,，不能冷凍,，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對(duì)光敏感,，因此要避光保存,。

7. 試劑變質(zhì)的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí),，表示試劑可能變質(zhì)。

8. 加入顯色液后,，一般顯色時(shí)間為15～30min,。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到35min（或更長）,，但不得超過40min,。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間,。

9. 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【樣品zui低檢測(cè)限】

   谷物,、飼料  ……………………………………………  2.5ppb

   果汁、啤酒,、飲料  ……………………………………   1ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃,。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。