【概要】

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉,、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構劃分為1類致癌物，同時又是一種毒性*的劇毒物質,，廣泛存在于各種食物中,。玉米，花生,，大米,，小麥等谷物及其副產(chǎn)品是黃曲霉毒素的主要來源，同時飼料中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過動物代謝后產(chǎn)生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強的毒性和致癌性,，也廣泛存在牛奶,，血液，組織等食品中,。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一,，也是胃癌，腸癌等疾病的主要原因,，對人類的健康構成很大威脅,。世界各國對食品，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴格的*,。2010年6月1日開始施行的乳品安全國家標準中對乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測進行了規(guī)定,，主要使用的樣品前處理方法就是免疫親和柱凈化法,。

黃曲霉毒素M1【適用范圍及性能】

用于定性、定量檢測牛奶,，奶粉,，發(fā)酵乳，干酪,，奶油等樣品中的樣品前處理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥90%

【試驗原理】

本產(chǎn)品的測定的基礎是抗原抗體反應,，單克隆抗體連接在柱內(nèi)凝膠上,，樣品中的經(jīng)過提取、過濾,、稀釋,，然后將樣品提取液緩慢的通過免疫親和層析柱，在免疫親和柱內(nèi),，毒素與抗體結合,，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結合的其他物質。用甲醇洗脫,，然后注入到分析儀器中用于檢測,。

【包裝組成】

根據(jù)不同規(guī)格，每一個盒中包含5-25支黃曲霉毒素免疫親和層析柱及1份說明書,。

【需要而未提供的設備及試劑】

設備：

┅┅高速均質器或組織勻漿機

┅┅粉碎機

┅┅200mL/50mL量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅酸度計

┅┅分液漏斗

┅┅微量移液器：單道 100?L～1000?L

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）

┅┅50mL漏斗

┅┅旋轉蒸發(fā)儀

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵流操作架（包括空氣泵,，不同容積的玻璃注射器等）

┅┅燒杯，容量瓶,，錐形瓶等

試劑：

┅┅甲醇（色譜級）

┅┅乙腈（色譜級）

┅┅石油醚

┅┅蒸餾水或去離子水

┅┅氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）稱取2g氫氧化鈉溶解于100mL水中

【樣本處理步驟】

（一）牛奶

┅┅將100mL牛奶水浴加熱至40 oC,；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

┅┅稱取10g奶粉樣品,，將100mL50 oC水多次少量加入,，攪拌，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min離心15min,，收集50mL清澈液待用

（三）發(fā)酵乳(包括固體狀,、半固體狀和帶果肉型)

┅┅稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4,；

┅┅用高速均質器在 9500 轉/分鐘下告訴勻漿5 min

┅┅水浴加熱至40 oC,；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（四）干酪

┅┅稱取經(jīng)切細,、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中,，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均質器在 9500r/分鐘下告訴勻漿5 min,；

┅┅超聲提取30 min,；

┅┅在6000r/分鐘下離心15 min,，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3）,，振搖2 min,；

┅┅待分層后，將下層移于50 mL燒杯中,，棄去石油醚層,。

┅┅重復用石油醚提取2次；,。

┅┅將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中,，減壓濃縮至約2 mL；┅┅濃縮液倒入離心管中,，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌,，洗滌液一并倒入50 mL離心管中；

┅┅加水稀釋至約50 mL,，在6000 轉/分鐘下離心 5 min,，上清液供凈化處理。

（五）奶油

┅┅稱取5g試樣,，置于50 mL燒杯中,；

┅┅用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇,，振蕩30 min后,，將全部液體移于分液漏斗中；

┅┅待分層后,，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中,，在旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL,，供凈化處理,。

【親和柱凈化步驟】

┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL清澈液注入玻璃注射器,；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,，調節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體,；

┅┅在注射器中加入10ml水,，調節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。

┅┅準確加入1mL色譜級乙腈洗脫,，流速為1 mL/min ~2mL/min,，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用,。

【結果判定】

經(jīng)免疫親和柱凈化后,，收集到的乙腈洗脫液可直接使用熒光計或者HPLC檢測,，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。收集到的1ml洗脫液中的黃曲霉毒素含量相當于10ml牛奶樣品,、發(fā)酵乳樣品或者1g奶粉樣品,、干酪樣品和奶油樣品中的含量。

如果HPLC檢測需要其它溶劑,，可以將乙腈洗脫液氮氣吹干,，然后復溶

【注意事項】

┅┅黃曲霉毒素危害極大，應戴手套操作,。

┅┅使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液用5%濃度的次氯酸鈉溶液浸泡過ye,。

┅┅不使用過了有效日期的免疫親和柱。

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：親和柱可于常溫保存,，2-8℃儲存可延長有效期,，不可凍存,。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月,。