實(shí)驗(yàn)原理
層析法是一種物理分離方法。柱層析法是層析方法中的一個(gè)類型,,分為吸附柱層析法和分配柱層析法,。本實(shí)驗(yàn)僅介紹吸附柱層析法,。
吸附柱層析法是分離,、純化和鑒定有機(jī)物的重要方法。它是根據(jù)混合物中各組分的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)(極性)來(lái)選擇合適的吸附劑和洗脫劑,,從而利用吸附劑對(duì)各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達(dá)到分離目的,。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經(jīng)過(guò)活化的多孔性或粉狀固體吸附劑(常用的吸附劑有氧化鋁,、硅膠等),。當(dāng)混合物溶液流過(guò)吸附柱時(shí),各組分同時(shí)被吸附在柱的上端,,然后從柱頂不斷加入溶劑(洗脫劑)洗脫,。由于不同化合物吸附能力不同,從而隨著溶劑下移的速度不同,,于是混合物中各組分按吸附劑對(duì)它們所吸附的強(qiáng)弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶,。
在洗脫過(guò)程中,柱中連續(xù)不斷地發(fā)生吸附和溶解的交替現(xiàn)象,。被吸附的組分被溶解吸出來(lái),,隨著溶劑向下移動(dòng),又遇到新的吸附劑顆粒,,把組分從溶液中吸附出來(lái),,而繼續(xù)流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動(dòng),這樣經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間移動(dòng)后,,各種組分就可以*分開(kāi),,繼續(xù)用溶劑洗脫,吸附能力zui弱的組分隨溶劑首先流出,,再繼續(xù)加溶劑直至各組分依次全部由柱中洗出為止,,分別收集各組分。
綠色植物如菠菜葉中的葉綠體含有綠色素(包括葉綠素a和葉綠素b)和黃色素(包括胡蘿卜素和葉黃素)兩大類天然色素,。這兩類色素都不溶于水,,而溶于有機(jī)溶劑,故可用乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑提取,。
葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式即葉綠素a(C55H72O5N4Mg)和葉綠素b(C55H70O6N4Mg),,其差別僅是葉綠素a中一個(gè)甲基被甲酰基所取代從而形成了葉綠素b,。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡(luò)合物,,是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a 的含量通常是b 的3 倍,。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團(tuán),,但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。
胡蘿卜素(C40H56)是具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯,。它有三種異構(gòu)體,即a-胡蘿卜素,、β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素,,其中β-胡蘿卜素含量zui多,也zui重要,。在生物體內(nèi),,β-胡蘿卜素受酶催化氧化形成維生素A。目前β-胡蘿卜素已可進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn),,可作為維生素A 使用,,也可作為食品工業(yè)中的色素。
葉黃素(C40H56O2)是胡蘿卜素的羥基衍生物,,它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍,。與胡蘿卜素相比,葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小,。
石油醚是一種脂溶性很強(qiáng)的有機(jī)溶劑,。葉綠體中的四種色素在石油醚中的溶解度是不同的:溶解度高的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得快;溶解度低的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得慢,。溶解度zui高的是胡蘿卜素,,它隨石油醚在濾紙上擴(kuò)散得zui快,葉黃素和葉綠素a的溶解度次之,;葉綠素b的溶解度zui低,,擴(kuò)散得zui慢。這樣,,四種色素就在擴(kuò)散過(guò)程中分離開(kāi)來(lái),。
同樣,提取液可用色層分析的原理加以分離,。因吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同,,當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí),混合物中各成分在兩相(流動(dòng)相和固定相)間具有不同的分配系數(shù),,所以它們的移動(dòng)速度不同,,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間層析后,便將混合色素分離,。
本實(shí)驗(yàn)是用活性氧化鋁作吸附劑,,分離菠菜中胡蘿卜素、葉黃素,、葉綠素a和葉綠素b,。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 硅膠 G
2. 中性氧化鋁
3. 甲醇
4. 石油醚( 60-90 ℃)
5. 丙酮
6. 乙酸乙酯
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 研缽
2. 布氏漏斗
3. 圓底燒瓶
4. 直形冷凝管
5. 色譜柱
6. 抽濾瓶
7. 燒杯
8. 鐵架臺(tái)
9. 脫脂棉723分光光度計(jì)
實(shí)驗(yàn)材料
菠菜葉
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 菠菜色素的提取
取2g 新鮮菠菜葉,與10mL 甲醇拌勻研磨5 分鐘,,棄去濾液,。殘?jiān)?0mL 的石油醚-甲醇(3:2)混合液進(jìn)行提取,,共提取兩次。合并液用水洗后棄去甲醇層,,石油醚層進(jìn)行干燥,、濃縮。
2. 薄層層析
將上述的濃縮液點(diǎn)在硅膠G 的預(yù)制板上,,分別用石油醚-丙酮(8:2)和石油醚-乙酸乙酯(6:4)兩種溶劑系統(tǒng)展開(kāi),,經(jīng)過(guò)顯色后,進(jìn)行觀察并計(jì)算比移值,。
3. 柱層析
取3g 中性氧化鋁進(jìn)行濕法裝柱,。填料裝好后,從柱頂加入上述濃縮液,,用石油醚-丙酮(9:1),、石油醚-丙酮(7:3)和正丁醇-乙醇-水(3:1:1)進(jìn)行洗脫,依次接收個(gè)色素帶,,即得胡蘿卜素(橙黃色溶液),、葉黃素(黃色溶液)、葉綠素a(藍(lán)綠色溶液)以及葉綠素b(黃綠色溶液),。
稱取12g堿性三氧化二鋁加入30mL石油醚攪拌,,浸泡10min。在層析柱內(nèi)加入一團(tuán)棉花(棉花要盡量?。┰诘撞吭偌尤?.5cm的石英砂,,然后用石油醚半充滿柱子,再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi),,倒時(shí)應(yīng)該緩慢,,重復(fù)使用下面的石油醚,直到裝完,。用石油醚洗柱內(nèi)壁,,頂部加一小團(tuán)棉花,然后再加入石英砂0.5cm高,。
樣品的分離層析
將濃縮液小心地從柱頂部加入,。加完后打開(kāi)活塞,讓液面下降到柱中砂層,,關(guān)閉活塞,,加幾滴石油醚沖洗內(nèi)壁,打開(kāi)活塞,,使液面下降如前,,在柱頂小心加入約1.5—2cm高度的石油醚-丙酮洗脫劑,層析即開(kāi)始進(jìn)行。
當(dāng)*個(gè)有色成分即將滴出時(shí),,另取一潔凈的燒杯收集,,得黃色溶液,即胡蘿卜素,。將洗脫劑換成1:7的石油醚-丙酮混合液,,繼續(xù)洗脫可得到第二色帶的黃綠色溶液,即葉綠素a和葉黃素,。
注意事項(xiàng)
1. 選材時(shí)要注意選取新鮮,、顏色深的葉片,。
2. 用丙酮和層析液都是易揮發(fā)且有一定毒性的有機(jī)溶劑,,所以研磨時(shí)要快,收集的濾液要用棉塞塞住,,層析時(shí)要加蓋,,減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。
3. 在研磨時(shí)加入少許SiO2,,目的是為了研磨得充分,;加入少許CaCO3的目的是為了防止研磨時(shí)葉綠體中色素受到破壞;加入丙酮的目的是作為葉綠體中色素的溶劑,。
4. 研磨過(guò)程中丙酮要少量多次加入,,以免研磨時(shí)四處飛濺。
5. 過(guò)濾時(shí)不要使用濾紙而使用棉花,,棉花塞在漏斗基部要松緊適當(dāng),。
6. 葉綠素要避光保存。葉黃素易溶于醇而在石油醚中溶解度較小,,從嫩綠菠菜得到的提取液中,,葉黃素含量很少,柱色譜中不易分出黃色帶,。
7. 萃取時(shí)不要?jiǎng)×艺袷?,以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象。
8. 為了保持柱子的均一性,,使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的,,否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí),就會(huì)使柱身干裂,,影響滲透和顯色的均一性,。因此要保證整個(gè)裝樣過(guò)程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面。
9. 在吸附劑上端加入脫脂棉(或?yàn)V紙)是使加樣品時(shí)不致把吸附劑沖起,;在吸附柱下端加脫脂棉(或沙子)可以防止吸附劑細(xì)粒流出,。
10. 層析柱填裝緊密與否,對(duì)分離效果很有影響,若各部分松緊不勻,,會(huì)影響滲透速度和顯色的均勻,。
11. 注意洗脫劑的配比,胡蘿卜素出來(lái)后,,換成1:7的洗脫液,。
12. 洗脫流速不宜過(guò)快,避免因此壓緊凝膠,,色素分離不開(kāi),;也不要過(guò)慢,使柱裝得太松,,導(dǎo)致層析過(guò)程中,,凝膠床高度下降,色素洗脫很慢,。因此應(yīng)控制洗脫流速,,以每分鐘60~80滴為宜。
13. 樣品一定要足夠濃縮,,加樣量不要過(guò)大或過(guò)小,。
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