大鼠蛋白激酶（GSK -3 β）活性檢測試劑盒（ELISA）

使用說明書

【試劑盒名稱】

大鼠蛋白激酶（GSK -3 β）活性檢測試劑盒（ELISA）

【試劑盒用途】

檢測大鼠血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中蛋白激酶（GSK -3 β）的活性,。

【檢測原理】

本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）,。將標(biāo)準(zhǔn)品,、待測樣本加入到預(yù)先包被大鼠蛋白激酶（GSK -3 β）抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時間后,，洗滌除去未結(jié)合的成分,，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時間后,，洗滌除去未結(jié)合的成分,。依次加入底物A、B,，底物（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物,，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中大鼠蛋白激酶（GSK -3 β）濃度呈正相關(guān),，450nm波長下測定OD值,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計算樣本中大鼠蛋白激酶（GSK -3 β）活性,。

【試劑盒組成】

備注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：80,、40、20,、10,、5、2.5U/mL

【需要而未提供的試劑和器材】

1、37℃恒溫箱

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 精密移液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水
4. 一次性試管
5. 吸水紙

【操作步驟】

1,、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒,，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。

2,、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液,。

3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板,，固定于框架上,，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對照孔,，記錄各孔位置,，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）,；空白對照孔不加。

4,、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min,。

5、洗板：棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）,。

6,、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對照孔不加,。

7,、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

8,、洗板：棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）,。

9,、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL,，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s）,，37℃避光顯色15min。

10,、終止：取出酶標(biāo)板,，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11,、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi),，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

12,、計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值,，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值,，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù),。

【樣本要求】

1,、樣本不能含疊氮鈉（NaN₃），因為疊氮鈉（NaN₃）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑,。

2,、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗,。若不能立即試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3、樣本應(yīng)充分離心,，不得有溶血及顆粒,。

【注意事項】

1、實驗嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，實驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),。

2、酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存,。

3,、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照都做雙份檢測,，取平均值,，以減小實驗誤差。

4,、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍,，計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。

5,、若顯色過淺,，可適當(dāng)延長底物溫育時間。

6,、為避免交叉污染,，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭,；酶標(biāo)工作液,、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣,，不得碰到微孔,；不得重復(fù)使用封板膜。

7,、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用,，不同批號的試劑不得混用。

8,、底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。

【操作程序總結(jié)】

準(zhǔn)備試劑,，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板4次，加入酶標(biāo)試劑,，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板4次,，加入顯色液A、B,，37℃顯色15分鐘

加入終止液

15分鐘之內(nèi)讀OD值

計算

【檢測范圍】

  2.5U/mL – 80U/mL

【規(guī)格】

96人份/盒

【貯藏】

2-8℃,，避光防潮保存。

【有效期】

6個月