豬ELISA試劑盒實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平,。用純化的
豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次
加入腫瘤壞死因子α（TNF-α）,，再與HRP 標記的腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體結合,，
形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB 顯色,。TMB 在HRP 酶的催
化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子
α（TNF-α）呈正相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，通過標準曲線計
算樣品中豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度。
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液20ml×1 瓶7 終止液6ml×1 瓶
2 酶標試劑6ml×1 瓶8 標準品（800pg/ml） 0.5ml×1 瓶
3 酶標包被板12 孔×8 條9 標準品稀釋液1.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液6ml×1 瓶10 說明書1 份
5 顯色劑A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 張
6 顯色劑B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 個
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品,，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
豬腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋,。
400pg/ml 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
200pg/ml 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
100pg/ml 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
50pg/ml 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
25pg/ml 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）,、標準孔,、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，
然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡
量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘,。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去,，如此
重復5 次,，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零,，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）,。測定應在加終止
液后15 分鐘以內進行。
操作程序總結：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線,，根據樣品的
OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，
即為樣品的實際濃度。
豬ELISA試劑盒注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未
用完,，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器,，并經常校對其準確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內,，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。如標本中待測物質含量過高（樣本OD 值
大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定,，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6．底物請避光保存,。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準,。
豬ELISA試劑盒保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃,。
2．有效期：6 個月