聲明：尊敬的客戶(hù),，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測(cè)血清,、血漿或其
它相關(guān)生物液體中天然和重組 VD 濃度,。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分！

試劑盒組成： 
中文名稱(chēng) 英文名稱(chēng) 規(guī)格 保存條件 
ELISA 酶標(biāo)板（可拆卸） Micro ELISA Plate(Dismountable) 8×12 / 8×6 * 4℃/-20℃ # 
凍干標(biāo)準(zhǔn)品 Reference Standard 2/1 支* 4℃/-20℃ # 
標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 Reference Standard & Sample Diluent 1 瓶 20mL/12mL * 4℃ 
濃縮生物素化抗體 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1 支 120μL/70μL * 4℃/-20℃ # 
生物素化抗體稀釋液 Biotinylated Detection Ab Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃ 
濃縮 HRP 酶結(jié)合物 Concentrated HRP Conjugate 1 支 120μL/70μL * 4℃(避光) 
酶結(jié)合物稀釋液 HRP Conjugate Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃ 
濃縮洗滌液（25×） Concentrated Wash Buffer (25×) 1 瓶 30mL/16mL * 4℃ 
底物溶液（TMB） Substrate Reagent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃(避光) 
反應(yīng)終止液 Stop Solution 1 瓶 10mL/6mL * 4℃ 
封板覆膜 Plate Sealer 5/3 張* 
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) Product Description 1 份 
質(zhì)檢報(bào)告 Certificate of Analysis 1 份 
特別說(shuō)明： 
*: [96T/48T]（打開(kāi)包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整） 
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃,，需長(zhǎng)時(shí)間存放或多次使用建議存于-20℃. 
相關(guān)試劑在分裝時(shí)會(huì)比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,，請(qǐng)?jiān)谑褂脮r(shí)量取而非直接倒出,！ 
 
檢測(cè)原理: 
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。用VD抗原包被于酶標(biāo)板上,，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的VD與包被的
VD競(jìng)爭(zhēng)生物素標(biāo)記的抗VD單抗上的結(jié)合位點(diǎn),，游離的成分被洗去。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的
親和素,，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB),，
TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色,，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)
OD值,，VD濃度與OD450值之間呈反比,，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中VD的濃度,。 
 
 
  
 
 
3 
樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃隔夜后于1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原,，無(wú)內(nèi)毒素試管,。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,，取上清即可
檢測(cè),。避免使用溶血，高血脂樣品,。 
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)
影響測(cè)量結(jié)果），稱(chēng)重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組
織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融,。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，
取上清檢測(cè)。 
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片,。取上清檢測(cè)。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè) 
具體處理方法可參考：http://www.elabscience,。,。ｃｎ/index.php/resources/view/aid/17671.jsp 
6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除,。 
7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃,，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝,，凍
存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融,。 
8. 如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值,，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋?zhuān)ńㄗh先
做預(yù)實(shí)驗(yàn),，以確定稀釋倍數(shù)）,。 
 
試驗(yàn)所需自備物品: 
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片) 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱,，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
 
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作: 
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25),。未用完的放回4℃,。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶，屬于正?，F(xiàn)象,，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過(guò)50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）,。當(dāng)日使用 
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘,，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋,，
靜置10分鐘,，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后,，用移液器將其輕輕混勻（濃度為400ng/mL）,。
然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诜磻?yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)＝ㄗh配制成以下濃
度：400,、200,、100、50,、25,、12.5,、6.25、0ng/mL,，標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔
0ng/mL,。如配制200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL400ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&
樣品稀釋液的EP管中，混勻即可,，其余濃度依此類(lèi)推,。 
4. 生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以50μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配 
 
 
4 
制100-200μL,。使用前15分鐘,，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當(dāng)日使用,。 
5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘,，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度,。
當(dāng)日使用。 
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例,，也可根據(jù)實(shí)際用量來(lái)稀釋?zhuān)?00μL/管） 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 
 400 200 100 50 25 12.5 6.25 0 ng/mL 
 
洗滌方法: 
1. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL,，注入與吸出間隔60秒。 
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL,，浸泡1-2分鐘,，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干,。 
 
操作步驟: 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí),，均需充分混勻,，并盡量避免起泡。 
1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 50μL,，余孔分
別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 50μL，立即每孔加入配好的生物素化抗體工作液 50μL（在使用前
15 分鐘內(nèi)配制）,，注意不要有氣泡,，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕
晃動(dòng)混勻,。給酶標(biāo)板覆膜,，37℃孵育 45 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新
的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。 
2. 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板 3 次,，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL /每孔,，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,。 
3. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜,，37℃溫育 30 分鐘,。 
4. 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板 5 次,，方法同步驟 3。 
5. 每孔加底物溶液(TMB)90μL,，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯色情
況酌情縮短或延長(zhǎng),，但不可超過(guò) 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí),，即可終止）,。 
6. 每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的 
 
5 
加入順序相同。 
7. 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD 值）,。應(yīng)提前打開(kāi)酶標(biāo)儀電源,，預(yù)熱儀
器，設(shè)置好檢測(cè)程序,。 
8. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束,。 
 
注意事項(xiàng)： 
1. 保存：試劑盒中各試劑請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)
光中,。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,，否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。 
2. 酶標(biāo)板：剛開(kāi)啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成
任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋,，按推薦溫度存放,！ 
3. 加樣：加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的
“預(yù)溫育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間控制在
10分鐘內(nèi),。推薦設(shè)置復(fù)孔,。 
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜,；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，避免酶標(biāo)
板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度,。 
5. 洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸
水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù),。 
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，
運(yùn)輸過(guò)程會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋,，因此使用*0轉(zhuǎn)/分離心1min,，以使附著管壁或瓶蓋的
液體沉積到管底。取用前,，請(qǐng)用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻,。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工
作液,、酶結(jié)合物工作液請(qǐng)根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請(qǐng)
配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時(shí),，
一次不要小于10μL）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)
準(zhǔn)品,、生物素化抗體工作液,、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分
裝,，將其放在-20～-80℃貯存,。避免反復(fù)凍融,。 
7. 顯色時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很
明顯,，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免顏色過(guò)深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 
8. 底物：底物請(qǐng)避光保存,，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。 
9. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率),，如無(wú)微量
振蕩器,，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。 
10. 安全：試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作,。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品
時(shí),，請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。 
11. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外） 
12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,，嚴(yán)禁混用,，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果！ 

結(jié)果判斷: 
1. 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如有設(shè)置復(fù)孔,，則應(yīng)取其平均
值計(jì)算,。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，
標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo),，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),。 
2. 推薦使用專(zhuān)業(yè)的曲線(xiàn)制作軟件，如curve expert 1.3或1.4,，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,，
由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方程
式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。 
3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù),。 
 
靈敏度,、檢測(cè)范圍、特異性和重復(fù)性: 
●靈敏度：zui小可測(cè) 3.75ng/mL,。 
●檢測(cè)范圍：6.25–400ng/mL,。 
● 特異性：可檢測(cè)重組或天然的 VD，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng),。 
● 重復(fù)性：板內(nèi),，板間變異系數(shù)均<10%。 
 
操作概要 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 50μL 
2. 立即加入 50μL 生物素化抗體工作液,，37℃孵育 45 分鐘 
3. 洗滌 3 次 
4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液,， 37℃孵育 30 分鐘 
5. 洗滌 5 次 
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右 
7. 加入 50μL 終止液,，立即在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量 OD 值 
8. 結(jié)果計(jì)算

問(wèn)題分析 
若實(shí)驗(yàn)效果不好,，請(qǐng)及時(shí)對(duì)顯色結(jié)果拍照，保留所用板條及未使用試劑,，并妥善保存,，然后聯(lián)
系我公司為您解決問(wèn)題。同時(shí)您也可以參考以下資料： 
問(wèn)題描述 可能原因 相應(yīng)對(duì)策 
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)梯
度差 
吸液或加液不準(zhǔn) 檢查移液器及吸頭 
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不正確 溶解標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)稍微旋轉(zhuǎn)瓶身,，輕輕混勻使粉末*溶解 
洗滌不* 保證洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量 
顯色很弱或
無(wú)色 
孵育時(shí)間太短 保證充足的孵育時(shí)間 
實(shí)驗(yàn)溫度不正確 使用推薦的實(shí)驗(yàn)溫度 
試劑體積不夠或漏加 
檢查吸液及加液過(guò)程,，保證所有試劑按順序足量添加 
稀釋不正確 
讀數(shù)數(shù)值低 酶標(biāo)儀設(shè)置不正確 
在酶標(biāo)儀上檢查波長(zhǎng)及濾光片設(shè)置 
提前打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱 
變異系數(shù)大 加液不正確 檢查加液情況 
背景值高 
檢測(cè)抗體的工作濃度
過(guò)高 
使用推薦的稀釋倍數(shù) 
酶標(biāo)板洗滌不* 
重新閱讀操作手冊(cè)，保證清洗*,；如果用自動(dòng)洗板機(jī),，
請(qǐng)檢查所有的出口是否有堵塞 
洗液有污染 配制新鮮的洗液 
靈敏度低 
ELISA 試劑盒保存
不當(dāng) 
按說(shuō)明書(shū)要求保存相關(guān)試劑 
讀數(shù)前未終止 OD 讀數(shù)前應(yīng)在每孔中加入終止液 
 
聲明 
1. 限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對(duì)所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析,，本產(chǎn)品可能存在
一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn),。 
2. zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),，請(qǐng)務(wù)
必準(zhǔn)備充足的待測(cè)樣品,。 
3. 只有全部使用試劑盒內(nèi)的試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品,。只有嚴(yán)格
遵守 Elabscience 的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到*的檢測(cè)結(jié)果,。 
4. 有效期：6 個(gè)月。 
5. 本操作說(shuō)明同樣適用于 48T 試劑盒,。