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小鼠抑制素B(Inhibin B)試劑盒檢測原理

來源:上海研生實(shí)業(yè)有限公司   2015年02月27日 13:51  

小鼠抑制素B(Inhibin B)試劑盒檢測原理

本試劑僅供研究使用  標(biāo)本:血清或血漿

試驗(yàn)原理:
小鼠抑制素Inhibin B試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知Inhibin B濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將Inhibin B和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育,。洗滌后,,加入親和素標(biāo)記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,,然后加入底物A,、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用,。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中Inhibin B的濃度呈比例關(guān)系。

操作注意事項(xiàng)
1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,,使用前恢復(fù)到室溫,。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存,。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,,密封保存,以免變質(zhì),。
3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用,。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,,吸取終止液和底物A、B液時(shí),,避免使用帶金屬部分的加樣器,。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。
6. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。
7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時(shí)間打開蓋子,。底物B對光敏感,,避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,,有毒,。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣,。
9. 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。

樣品收集,、處理及保存方法
1、 血清-----小鼠抑制素Inhibin B操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。
2,、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測,。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。
3,、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4,、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎,。1000×g離心10分鐘,取上清液
5,、 保存------如果樣品不立即使用,,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備
1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,,不能儲存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進(jìn)行:
80 IU/ml (6號標(biāo)準(zhǔn)品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
40 IU/ml (5號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
20 IU/ml (4號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
10 IU/ml (3號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
5.0 IU/ml (2號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.5 IU/ml (1號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 IU/ml (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul,。

2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟
1. 使用前,將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差,。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育1小時(shí)。
4. 甩去孔內(nèi)液體,,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,甩去洗滌液,,用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,,洗滌次數(shù)增加一次,。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,,37℃溫育30分鐘,。
6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,,振蕩30秒,,甩去洗滌液,用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A,、B各50ul,,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘,。避免光照,。
8. 小鼠抑制素Inhibin B取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果,。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng),。
3. 重復(fù)性:板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1,、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的Inhibin B標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),,做得相應(yīng)的曲線,,樣品的Inhibin B含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出濃度。

3,、檢測值范圍:0-80IU/ml

4,、敏感度: 0.1 IU/ml

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