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染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

來源:上海雅吉酶聯(lián)免疫科技公司   2015年02月02日 13:58  

實驗方法原理    在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時,通過運用對應(yīng)于一個特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體,染色質(zhì)被切成很小的片斷,并沉淀下來。

IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法,。

目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,,beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的,。

實驗材料    細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒    甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脫液RNaseA蛋白酶Komega膠回收試劑盒
儀器,、耗材    離心管超聲儀電泳儀離心機(jī)
實驗步驟    
一,、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎( *天)
 
1.  取出1平皿細(xì)胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,,使得甲醛的終濃度為1%(培養(yǎng)基共有9 ml),。
 
2.  37℃孵育10 min。
 
3.  終止交聯(lián):加甘氨酸至終濃度為0.125 M,。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中,。混勻后,,在室溫下放置5 min即可,。
 
4.  吸盡培養(yǎng)基,,用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。
 
5.  細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15 ml離心管中(PBS依次為5 ml,,3 ml和3 ml),。預(yù)冷后2 000 rpm 5 min收集細(xì)胞。
 
6.  倒去上清,。按照細(xì)胞量,,加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個細(xì)胞,。這樣每100 ul溶液含1×106個細(xì)胞,。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×106個細(xì)胞,。本次細(xì)胞長得約為80%,。即為4×106個細(xì)胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer,。將2管混在一起,共800 ul,。
 
7.  超聲破碎:VCX750,,25%功率,4.5 s沖擊,,9 s間隙,。共14次。
 
二,、除雜及抗體哺育 ( *天)
 
1.  超聲破碎結(jié)束后,,10 000 g 4℃離心10 min。去除不溶物質(zhì),。
 
2.  留取300ul做實驗,,其余保存于-80℃。
 
3.  300 ul中,,100 ul加抗體做為實驗組,;100 ul不加抗體做為對照組;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl終濃度為0.2 M),,65℃處理3 h解交聯(lián),,跑電泳,檢測超聲破碎的效果,。
 
4.  在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中,,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。
 
再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA,。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1 h,。
 
5.  1 h后,,在4℃靜置10 min沉淀,700 rpm離心1 min,。
 
6.  取上清,。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體,,另一管中則不加抗體,。4℃顛轉(zhuǎn)

 
三,、檢驗超聲破碎的效果 ( *天)
 
1.  取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物,,加入4 ul 5M NaCl,65℃處理2 h解交聯(lián),。

2.  分出一半用酚/氯仿抽提,。電泳檢測超聲效果。
 
四,、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗( 第二天)
 
1.  孵育后,,每管中加入60 ul ProteinA  Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)2 h,。
 
2.  4℃靜置10 min后,,700 rpm離心1 min。除去上清,。
 
3.  依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物,。清洗的步驟:加入溶液,在4℃顛轉(zhuǎn)10 min,,4℃靜置10 min沉淀,,700 rpm離心1 min,除去上清,。
 
洗滌溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash
 
(2)highsalt wash buffer-one wash
 
(3)LiCl wash buffer-one wash
 
(4)TE buffer-two wash
 
4.  清洗完畢后,,開始洗脫。

洗脫液的配方:100 ul 10%SDS,,100 ul1M NaHCO3,,800 ul ddH2O,共1 ml,。
 
每管加入250 ul洗脫buffer,,室溫下顛轉(zhuǎn)15 min,靜置離心后,,收集上清,。重復(fù)洗滌一次。zui終的洗脫液為每管500 ul。
 
5.  解交聯(lián):每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl終濃度為0.2 M),。
 
6.  混勻,,65℃解交聯(lián)。
 
五,、DNA樣品的回收(第三天)
 
1.  解交聯(lián)結(jié)束后,,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h,。
 
2.  每管加入10 ul 0.5 M EDTA,,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K,。45℃處理2 h,。
 
3.  DNA的回收----omega膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于100 ul ddH2O,。
 
六,、PCR分析(第三天)
 
 
收起 
注意事項    
1. 注意抗體的性質(zhì)??贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同,,免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說明書,。特別是多抗的特異性是問題,。

2.  注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白,,特別是骨架蛋白,,緩沖液必須要使其溶解,。為此,,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合,。另一面,,如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞,就不能充分溶解細(xì)胞蛋白,。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果,,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結(jié)合,,即使IP成功,,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。

3.  為防止蛋白的分解,,修飾,,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進(jìn)行實驗。每次實驗之前,,首先考慮抗體/緩沖液的比例,。抗體過少就不能檢出抗原,,過多則就不能沉降在beads上,,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,,過多則抗原被稀釋,。
收起 
其他    
一、染色質(zhì)免疫共沉淀簡介 

真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在,。因此,,研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前*研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法,。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,,并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA段,,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息,。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用,,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且,,CHIP與其他方法的結(jié)合,,擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍:CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合,,用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點,;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見,,隨著CHIP的進(jìn)一步完善,,它必將會在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

二,、ChIP的一般流程
 
甲醛處理細(xì)胞---收集細(xì)胞,,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA,,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物,,并沉淀---對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗,除去一些非特異性結(jié)合---洗脫,,得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián),,純化富集的DNA-片斷---PCR分析,。
 
三、PCR分析

ChIP-chip技術(shù)對于大規(guī)模挖掘順式調(diào)控信息成績,,同時它可以用于胚胎干細(xì)胞和一些疾病如癌癥,、心血管疾病和*神經(jīng)紊亂的發(fā)生的機(jī)制。研究人員還可以利用這項技術(shù)開發(fā)一些治療方法,。目前ChIP-chip技術(shù)研究主要集中于兩個領(lǐng)域:及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和條件特異性,;組蛋白的修飾,組蛋白修飾蛋白和染色體重建,。
 
ChIP-chip在描述轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子動力學(xué)中的研究,、染色體結(jié)構(gòu)組分的分布、在組蛋白的修飾,、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應(yīng)用也十分廣泛,。ChIP-chip 技術(shù)的優(yōu)點是,可以在體內(nèi)進(jìn)行反應(yīng),;在給定的檢驗細(xì)胞環(huán)境的模式下得到DNA相互關(guān)系的簡單影像,;使用特異性修正抗體鑒定與包含有一個特異性后轉(zhuǎn)錄修正的蛋白質(zhì)的相關(guān)位點;直接或者間接(通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用)的鑒別基因組與蛋白質(zhì)的相關(guān)位點,。缺點是:需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體,,有時難于獲得;為了獲得高豐度的結(jié)合片段,,必須實驗演示胞內(nèi)條件下靶標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,;調(diào)控蛋白質(zhì)的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。
 
總之,,ChIP-chip 技術(shù)的發(fā)展為析活細(xì)胞或組織中DNA與蛋白質(zhì)的相互關(guān)系提供了一個極為有力的工具,。在未來的研究中,將對芯片的構(gòu)建進(jìn)行改進(jìn),,提高其實用性,。使用易于獲得抗體,增加這種方法的可用性,。

在PCR分析這一塊,,比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR,。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及,,大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法,。例如RIP(其實就是用ChIP的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合,,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,,zui后分析的時候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA),;還有ChIP-chip(其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變,,不同的公司有不同的做法,,要根據(jù)公司的要求來準(zhǔn)備樣品)。

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