熒光定量PCR熒光為基礎(chǔ)對核酸進(jìn)行定量分析，其應(yīng)用非常廣泛,，可以用于檢測基因的表達(dá)量（RNA的豐度），驗(yàn)證表達(dá)譜芯片或轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù),，確定病原體的載量,，對片段的拷貝數(shù)（CNV）進(jìn)行分析，對基因進(jìn)行分型等等,。其原理為通過監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化,，記錄檢測熒光達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（Ct值）。從理論上說,，起始模板量和Ct值密切相關(guān),，因此我們通過判讀Ct值從而對樣本進(jìn)行定量。熒光定量PCR從方法上來說可以分為染料法和探針法兩種,。

染料法

在國內(nèi),，染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ，染料法使用簡單,，成本也相對較低,，因此會(huì)有很多國內(nèi)研究者會(huì)選擇使用染料法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在染料法熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中,，染料能夠與雙鏈結(jié)合,，從而發(fā)光，而在游離狀態(tài)下,，SYBRGreen I發(fā)出微弱的熒光,。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量呈比列,，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加,。

但是染料法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA，因此一些非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體的出現(xiàn),，會(huì)極大的影響真實(shí)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此,，一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標(biāo)準(zhǔn),，用來校正背景，但是即便如此,，染料法特異性的問題依舊無法與探針法相比,。另外染料法無法在同一個(gè)反應(yīng)中檢測多個(gè)目的片段,，對于復(fù)雜序列，如果難以擴(kuò)增的話,，也會(huì)受到脫靶效應(yīng)（如引物二聚體）的影響,。在這種情況下，就需要在實(shí)驗(yàn)前期進(jìn)行熔解曲線分析,，判斷擴(kuò)增所得產(chǎn)物是否只有一種,。

TaqMan探針法

TaqMan探針法PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對擴(kuò)增引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針,。Taqman探針為一段線性的寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（FAM或Hex等）和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,，PCR儀檢測不到熒光信號；當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段）,，Taq酶的5' －3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR 產(chǎn)物形成*同步,，這也就是探針法定量的原理,。

探針法與染料法的較為大區(qū)別在于，理論上探針法中的熒光信號只來源于目標(biāo)序列,，也就是不受非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的影響,。除此之外，人們還可以利用不同探針,，在一個(gè)體系中使用不同的熒光標(biāo)記同時(shí)檢測多種指標(biāo),，達(dá)到節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本的目的。在樣本量比較大的情況下,，成本甚至可以低于染料法,。

因此我們可以看到，在選擇熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí),，探針法在特異性和準(zhǔn)確性方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于廉價(jià)的染料法,，但在實(shí)際使用時(shí)，TaqMan探針高昂的價(jià)格常常讓人望而卻步,。目前,，上海捷瑞生物工程有限公司在強(qiáng)大的探針合成能力的前提下，推出了探針法熒光定量PCR服務(wù),，以染料法的價(jià)格,，享受探針法的服務(wù),，在相同的經(jīng)費(fèi)情況下，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和特異性,。

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