本文主要簡單闡述了southern雜交,、Northern雜交,、原位雜交,、點(diǎn)雜交這幾種核酸雜交方法的異同點(diǎn),。并介紹了點(diǎn)雜交的基本概念及實(shí)驗(yàn)原理、方法,。

幾種核酸雜交技術(shù)的比較 點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)原理,、步驟
幾種核酸雜交技術(shù)的比較  點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)原理、步驟

（1）幾種核酸雜交的異同點(diǎn)

核酸雜交是分子生物學(xué)的基本技術(shù),，也是遺傳學(xué)研究和基因診斷的常用方法,。核酸雜交的形式有多種,，其中zui常用的是Southern雜交、Northern雜交,、原位雜交,、點(diǎn)雜交等。雖然形式多樣,，但都是基于核酸分子的堿基互補(bǔ)原理,。從雜交材料來看，雜交分為DNA-DNA雜交,、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交,。從雜交分子狀態(tài)來看，雜交分為液相-固相雜交和液相-液相雜交,。

上述幾種雜交都屬于液相-固相雜交,，即將參與雜交的一方分子固定在固相的支持載體上，另一方分子以液相形式參與雜交,。參與雜交的雙方分子必有一方被標(biāo)記,，以便產(chǎn)生能夠被檢出的雜交信號;在液相-固相雜交中往往液相分子被標(biāo)記，這樣才能產(chǎn)生有意義的差別信號,。在雜交在中,，被標(biāo)記的分子稱為探針，而與探針進(jìn)行雜交的分子稱為被檢測樣品(被檢分子),。大多數(shù)液相-固相雜交中被檢樣品往往是混合分子,，如提取的基因組DNA或某種組織的RNA，并且將被檢樣品固定在載體上,，而探針往往是單一分子,，如某一基因的片斷。雜交結(jié)果是根據(jù)信號的強(qiáng)弱和位置進(jìn)行判斷,，如被檢分子的分子量(或長度)，被檢分子的表達(dá)強(qiáng)度等,。這種雜交適用于相同基因片斷對不同樣品的檢測,。若進(jìn)行一種樣品被不同基因片斷的檢測時(shí)，就必須采取反向的方式,，即將不同的基因片斷固定在載體上,，而將被檢樣品制成液相并進(jìn)行標(biāo)記。這種反向的方式稱為反向雜交,，反向雜交中被標(biāo)記的樣品也可以稱為探針,。

在液相-固相雜交中固相載體往往采用尼龍膜或醋酸纖維膜，這些經(jīng)過特殊處理的材料對核酸分子具有強(qiáng)大的吸附力,，在操作中不易脫落,。探針標(biāo)記往往采用放射性標(biāo)記,，如32P、35S等,，由于放射性物質(zhì)的危害性,，現(xiàn)在非放射性標(biāo)記也在廣泛使用，如生物素標(biāo)記,、標(biāo)記等,。一般來說，放射性標(biāo)記適用于Southern雜交,、Northern雜交和點(diǎn)雜交,，非放射性標(biāo)記適用于原位雜交。放射性標(biāo)記靈敏度高,，線形范圍寬,，非放射性標(biāo)記定位性強(qiáng)，沒有衰變,，危害小,。

（2）點(diǎn)雜交的概念

點(diǎn)雜交(dot blot)是雜交信號呈現(xiàn)斑點(diǎn)樣的雜交方法，在操作上是把參與雜交的一方分子點(diǎn)樣到膜上,。由于雜交分子預(yù)先沒有進(jìn)行像Southern雜交和Northern雜交之前的電泳分離,，也沒有像原位雜交那樣，雜交一方的分子已經(jīng)表現(xiàn)出組織細(xì)胞分布的位置特異性,，所以點(diǎn)雜交的結(jié)果判斷*視雜交信號的強(qiáng)弱,，其信息量沒有其它雜交形式的信息量豐富。但點(diǎn)雜交的操作比較簡單,、結(jié)果直觀,、適用于大批樣品的檢測，因此它在許多方面也得到了廣泛的應(yīng)用,。

一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

理解核酸雜交原理;熟悉核酸雜交的一般方法，掌握膜斑點(diǎn)雜交技術(shù)和結(jié)果分析,。

二,、實(shí)驗(yàn)原理

點(diǎn)雜交是核酸雜交中比較簡單的一種技術(shù)，本質(zhì)上也是單鏈核酸分子通過堿基互補(bǔ)而形成雙鏈核酸的過程,，當(dāng)某單鏈分子被標(biāo)記后,，就可以檢測與其互補(bǔ)的分子。

(一)印跡

印跡(blot)就是將雜交一方的分子固定在膜上,，對于Southern雜交和Northern雜交,，往往采用毛細(xì)轉(zhuǎn)移，真空轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)移等方法,，使電泳分離的核酸分子“原位印跡”到膜上去,，而點(diǎn)雜交則可采取人工點(diǎn)樣的方法,，將核酸分子固定到膜上去。在點(diǎn)膜時(shí)還要借助其它使核酸分子固定的方法(如點(diǎn)膜器,、真空抽氣裝置)使分子更緊密地結(jié)合在膜上,，并且不擴(kuò)散。點(diǎn)雜交的印跡過程提供了一個固化平臺和陣列,，使雜交在已知位置上進(jìn)行,。

(二)標(biāo)記

標(biāo)記(labeling)就是使參與雜交的一方分子帶有可識別的物質(zhì)，使雜交后顯示信號,。常用標(biāo)記物有放射性同位素和非放射性物質(zhì),，標(biāo)記方法有隨機(jī)引物標(biāo)記法、缺口平移法和末端標(biāo)記法等,。在液相-固相雜交中,，標(biāo)記往往在液相分子上，使探針成為流動相,。標(biāo)記效率是影響雜交的重要因素,，在一定范圍內(nèi)，比活性(可以理解為單位分子中的標(biāo)記物數(shù)量與活性)越高越好,。在雜交中,，探針往往是過量的(雜交信號的強(qiáng)弱反映的是被檢樣品的量和基因豐度)，所以依靠增加探針量來提高雜交靈敏度的做法很有限的,，應(yīng)該提高探針的比活性,。