免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)為在細(xì)胞水平上研究免疫反應(yīng)做出了貢獻(xiàn)，但由于光學(xué)分辨率的限制,，不可能從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平觀察和研究免疫反應(yīng),。因此，Singer于1959年首先提出用電子密度較高的物質(zhì)鐵蛋白(ferritin)標(biāo)記抗體的方法,，為在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究抗原抗體反應(yīng)提供了可能,。在此基礎(chǔ)上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術(shù),、鐵蛋白抗鐵蛋白復(fù)合物技術(shù),、蛋白A-鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫酶技術(shù)及膠體金技術(shù)等,。電子顯微鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(以下簡稱免疫電鏡技術(shù)技術(shù))區(qū)別于免疫細(xì)胞化學(xué)和常規(guī)電鏡技術(shù)主要在以下幾方面：

一,、組織固定與取材

在這方面的要求是即要保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性,。因此,，選用固定劑不宜過強(qiáng)。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛—戊二醛混合液和過碘酸-賴氨酸—多聚甲醛液(Periodate—Lysine –Paraformaldehyde簡稱PLP液),。也有采用Bouin氏液,、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液(其配制法見附錄),。國外不少文獻(xiàn)推薦應(yīng)用PLP液于免疫電鏡技術(shù)，認(rèn)為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳,，因?yàn)榻M織抗原絕大多數(shù)由蛋白質(zhì)和糖兩部分組成,，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇性地使糖類固定,，就可使抗原性穩(wěn)定,。PLP液中過碘酸能氧化糖類，使其產(chǎn)生醛基,，再經(jīng)賴氨酸作用,，使新形成的醛基分子間和分子內(nèi)相互連接，穩(wěn)定組織抗原,。但賴氨酸價(jià)格較貴,，不如多聚甲醛戊二醛固定液經(jīng)濟(jì)、簡便,、效果佳,。在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速,、精細(xì),。

二、免疫染色

分為包埋前染色,、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種,。

1.包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取出,，修整成小塊,，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定,、脫水,、包埋。如果特異性免疫反應(yīng)的范圍太小,，為了準(zhǔn)確定位,，可作第二次包埋，即*次包埋時(shí)將組織置于兩層thermanox塑料片之間,，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式,，進(jìn)行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋,。包埋前染色的組織,，以中層較為理想。表層因受機(jī)械修整，結(jié)構(gòu)往往保存不好,，深層因抗體不能透入,，免疫反應(yīng)弱或無,。在作超薄切片前應(yīng)先切半薄切片,，尋出免疫反應(yīng)陽性部位。根據(jù)作者經(jīng)驗(yàn),，半薄切片可在相差顯微鏡下不染色進(jìn)行觀察(指PAP染色法),，免疫反應(yīng)部位呈黑點(diǎn)狀。在HE或甲苯胺藍(lán)染色的半薄切片上,，免疫反應(yīng)部位呈棕黃色,。據(jù)此定位作超薄切片，可大大提高陽性反應(yīng)檢出率,。為避免電鏡鉛,、鈾染色反應(yīng)與免疫反應(yīng)之間的混淆，可取相連續(xù)的起薄切片,，分別以兩個(gè)銅網(wǎng)撈取,，其中之一進(jìn)行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進(jìn)行對照觀察,。

包埋前染色法的優(yōu)點(diǎn)是：①切片染色前不經(jīng)過鋨酸后固定,、脫水及樹脂包埋等過程，抗原未被破壞,，易于獲得良好的免疫反應(yīng),。②可在免疫反應(yīng)陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率,。特別適用于含抗原量較少的組織,，但由于經(jīng)過一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結(jié)構(gòu)損傷,。

2.包埋后染色 組織標(biāo)本經(jīng)過固定,、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后,，再進(jìn)行免疫組化染色,。由于是以貼在網(wǎng)上的超薄切片進(jìn)行免疫染色，故又名之載網(wǎng)染色(on grid staining),。必須指出的是：①后固定中是否應(yīng)用存在不同意見,，作者經(jīng)驗(yàn)一般以不用為佳，或盡量縮短在中停留的時(shí)間,。有作者認(rèn)為,，從理論上講，具有保存抗原的作用，但實(shí)踐證明應(yīng)用可使抗原活性明顯減低,。②在載網(wǎng)染色過程中,，銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng),。③在免疫組化處理的全過程中,，應(yīng)注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)面干燥會影響抗體活性,。本法的優(yōu)點(diǎn)是超微結(jié)構(gòu)保存較好,，方法簡便，陽性結(jié)構(gòu)有高度的可重復(fù)性,，還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫染色,。但抗原活性在

電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失;環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì);包埋在環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基,，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì);包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進(jìn)行免疫反應(yīng)等,。因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法如飽和苯溶液,，*中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑,，取得不同程度的效果。現(xiàn)普遍采用的是在進(jìn)行免疫染色前,，以H2O2液蝕刻數(shù)分鐘,，以去鋨和增強(qiáng)樹脂的穿透性。

3.超薄冰凍切片 按照Tokuyasu建立的方法,，將組織置于2.3mol/L蔗糖液中,，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機(jī)上切片,，切片厚度可略厚于常規(guī)樹脂切片,。冰凍超薄切片由于不需經(jīng)固定、脫水,、包埋等步驟,，直接進(jìn)行免疫染色，所以抗原性保存較好,，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點(diǎn),。

三、包埋

(一)樹脂包埋

國內(nèi)現(xiàn)普遍采用的是環(huán)氧樹脂包埋法,，可直接脫水后包埋,，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合,、硬化,，進(jìn)行原位包埋。

(二)低溫包埋

常規(guī)樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失,。因此,，在免疫電鏡技術(shù)方面，國外不少實(shí)驗(yàn)室已開始采用低溫技術(shù)如低溫包埋和冰凍超薄切片等,，后者需配備冰凍超薄切片機(jī),，且技術(shù)難度較大，不如低溫包埋法易推廣,。低溫包埋劑的研究開始于60年代,，80年代免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的廣泛的應(yīng)用,，為低溫包埋劑的實(shí)驗(yàn)研究開辟了廣闊的領(lǐng)域,。國內(nèi)已有較多的應(yīng)用報(bào)道，國內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室已開始摸索,。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate,GMA),Lowicryls, LR White和Lr Gold等,，目前國外生產(chǎn)廠家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列產(chǎn)品。現(xiàn)將常用的幾種低溫包埋劑及其應(yīng)用簡單介紹如下：

Lowicryls 是丙烯酸鹽(acrylate) 和甲基丙烯酸鹽(methacrylate)化學(xué)物質(zhì),，包括K4M,、HM20、K11M,、KM23等系列產(chǎn)品(Polysciences INC),，其特點(diǎn)是能在低溫下保持低粘度(K4M：--35℃;HM20：-70℃;K11M、HM23：-60℃～-80℃)和具有在光照射(紫外光,，波長360nm)下聚合的能力,，它的光聚合作用與溫度無度。其中K4M和K11M具有親水性,，特別適合于免疫細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用,，因它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色,。HM20和HM23具疏水性,，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描,、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作,。所有這些種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術(shù)。