(一)酶標抗體的條件

1.純度高、含雜蛋白少,用IgG優(yōu)于血清抗體,，用Fab優(yōu)于IgG,。

2.特異性強 即抗IgG與IgG在免疫電泳上只有一條沉淀線,與IgG的全血清也只有一條沉淀線,這才算是特異性的單價抗體。

3.效價高 一般瓊脂擴散鑒定為1︰64以上才算合格,。

(二)酶標記方法

1.交聯(lián)法 交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛,，戊二醛商品大多為25%的水溶液，利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基,，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基,、酚基等以共價鍵結(jié)合而進行標記。標記時應(yīng)盡量采用新鮮純品,，當戌二醛的OD235nm/OD280nm<3時,，即為好的交聯(lián)劑。

戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步法,。

(1) 一步法：即把酶,、戊二醛和抗體一起加入進行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物,。由于抗體分子量大(16萬),，酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性小,。一步法操作：①抗IgG-AKP的制備：將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生,，*溶解后,，緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的zui終濃度為0.2%,，移至室溫中靜置2h~3h后,，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛，4℃保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱);②抗IgG-HRP的制備：將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL,，置室溫2h~3h,，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱,，避免反復(fù)凍融,。或冷凍干燥保存,。

(2) 二步法：是先使酶與戊二醛反應(yīng),除去未反應(yīng)的戊二醛,，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合，zui后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基,。二步法操作：將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h,，充分透析或以SephadexG25柱除去未反應(yīng)的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液,，混合后4℃冰箱放置24h,，加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸，置室溫2h,，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,，離心去沉淀，上清液即為酶結(jié)合物,，再進一步以硫酸銨沉淀純化后應(yīng)用,。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步標記法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中,，加入25%戊二醛0.1ml,，37℃溫育2h后加入冰冷的分析純的無水乙醇2ml，2 500r/min離心沉淀10min~15min,，傾去溶液,。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混懸，同上離心,，傾去乙醇,，將管倒置，使乙醇充分流出,。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解,，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右)，放在冰箱內(nèi)后,，加KH2 PO4,，使近中性即可應(yīng)用。

2.氧化法 采用過碘酸鈉,，過碘酸鈉是強氧化劑,，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關(guān)的部分)的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標抗體,。

(1)氧化法操作過程如下：將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中,，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4),，置室溫中輕攪30min,，在溶液呈黃綠色時，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,，在室溫中放置1h,，使氧化反應(yīng)中止,，然后在4℃中對0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次,。在3ml HRP-醛基溶液中,，加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)，室溫置2h~3h,，加入5mg氫化硼鈉(NaBH4),，于4℃冰箱放置3h或，然后用PBS液充分透析,，離心去沉淀物,。上清液即為酶結(jié)合物，純化后使用,。

(2)改良過碘酸鈉法：①取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中,，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水+128mg NaIO4) 0.5ml，混勻,，置4℃30min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,，室溫放置30min;③加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻,，并裝入透析袋,，對0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或)，使之結(jié)合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,，混勻,，置4℃2h;⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻,，4℃30min,，離心，去上清,，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,，裝入透析袋，以同樣液體在4℃透析除鹽;⑥次日取出離心,，以除去不溶物,，即得酶-抗體(HRP-IgG)結(jié)合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效價測定合格后,，加入等量甘油,，分裝小瓶，低溫保存,。