大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)酶聯免疫檢測

試劑盒使用說明書

使用前仔細閱讀本說明書,。本酶聯免疫試劑盒是基于生物素雙抗體夾心技術原理,，來檢測大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)),，只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學診斷。

用    途： 用于大鼠血清,、血漿及相關液體樣本中NADPH氧化酶(NADPH-OX)的測定,。

工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的水平。向預先包被了大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)單克隆抗體的酶標孔中加入NADPH氧化酶(NADPH-OX),，溫育,；溫育后，加入生物素標記的抗NADPH-OX抗體,，再與鏈霉親和素-HRP結合,，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌,，去除未結合的酶,，然后加入底物A,、B，產生藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的濃度呈正相關,。

試劑盒組成

需要而未提供的試劑和器材

1．37℃恒溫箱,。

2． 標準規(guī)格酶標儀。

3． 精密移液器及一次性吸頭

4． 蒸餾水,，

5． 一次性試管

6． 吸水紙

注意事項

1． 從2-8℃取出的試劑盒,，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完,，板條應裝入密封袋中保存,。

2． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。

3． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準,。

4． 為避免交叉污染,，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

5．  不用的其它試劑應包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質前使用。

6．  底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下,。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘,。根據需要,，重復此過程數次。

自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

標本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

2．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融

操作程序

1．  標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：

2．  根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數,。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔,。

3．  加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品,，生物素標記的抗NADPH-OX抗體，鏈霉親和素-HRP,，只加顯色劑A&B和終止液,，其余各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50μl,，鏈霉素-HRP50μl（標準品中已事先整合好生物素抗體,，故不加）；3)待測樣品孔:加入樣本40μl,，然后各加入抗- NADPH-OX抗體10μl,、鏈酶親和素-HRP50μl，蓋上封板膜,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育60分鐘。

4．  配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。

5．  洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。

6．  顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘。

7．  終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。

8．  測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。測定應在加終止液后10分鐘以內進行,。

9.根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度,。也可以使用各種應用軟件來計算,。

操作程序總結：

準備試劑,，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，生物素標記二抗和酶標試劑,，37℃反應60分鐘

洗板5次,，加入顯色液A、B,，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內讀OD值

計算

檢測范圍：10 pg/ml→300pg/ml,。

規(guī)格：    48T/盒

保存：    2-8℃

有效期：  6個月（2-8℃）。