大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)酶聯(lián)免疫檢測

試劑盒使用說明書

使用前仔細(xì)閱讀本說明書,。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于生物素雙抗體夾心技術(shù)原理,，來檢測大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)),，只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學(xué)診斷,。

用    途： 用于大鼠血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中NADPH氧化酶(NADPH-OX)的測定,。

工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的水平。向預(yù)先包被了大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入NADPH氧化酶(NADPH-OX),，溫育,；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗NADPH-OX抗體,，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,，形成免疫復(fù)合物,，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶,，然后加入底物A,、B,，產(chǎn)生藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的濃度呈正相關(guān),。

試劑盒組成

需要而未提供的試劑和器材

1．37℃恒溫箱,。

2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。

3． 精密移液器及一次性吸頭

4． 蒸餾水,，

5． 一次性試管

6． 吸水紙

注意事項

1． 從2-8℃取出的試劑盒,，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗誤差,。

3． 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),。

4． 為避免交叉污染,，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。

5．  不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用。

6．  底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下,。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

標(biāo)本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

操作程序

1．  標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：

2．  根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。

3．  加樣：1）空白孔：空白對照孔不加樣品,，生物素標(biāo)記的抗NADPH-OX抗體，鏈霉親和素-HRP,，只加顯色劑A&B和終止液,，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl,，鏈霉素-HRP50μl（標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體,，故不加）；3)待測樣品孔:加入樣本40μl，然后各加入抗- NADPH-OX抗體10μl、鏈酶親和素-HRP50μl,，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育60分鐘。

4．  配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。

5．  洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

6．  顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘。

7．  終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

8．  測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

9.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算,。

操作程序總結(jié)：

準(zhǔn)備試劑,，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑,，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板5次,，加入顯色液A、B,，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內(nèi)讀OD值

計算

檢測范圍：10 pg/ml→300pg/ml,。

規(guī)格：    48T/盒

保存：    2-8℃

有效期：  6個月（2-8℃）。