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小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞的分離－膠原酶消化制備脾臟細(xì)胞懸液
輔助方案：
膠原酶消化制備脾臟細(xì)胞懸液
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 4000U/ml膠原酶D,，融化后置于冰上
2. HBSS,，已滅菌,，含Ca+、Mg2+（購(gòu)置于Life Technologies）
3. 小鼠脾臟
4. 皮下注射針,，22G×11/2in內(nèi)徑（Becton Dickinson）
5. 10ml,、5ml一次性注射器（如Becton Dickinson）
6. 100mm直徑培養(yǎng)皿（如Falcon）
7. 2個(gè)高壓滅菌鍋的鋸齒狀解剖鑷（如Roboz）
8. 高壓滅菌的不銹鋼網(wǎng)：將40目的不銹鋼網(wǎng)剪成5cm×5cm的小方格，向下折疊邊緣,，然后將四邊彎成淺的矩形碗；錫箔紙包裹后高壓滅菌,。
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 將2管1ml的4000U/ml膠原酶D稀釋?zhuān)ㄗ銐蛴糜?0個(gè)脾臟）：1ml加入9ml HBSS（稀釋至4000U/ml,，步驟8使用），1ml加入39ml的HBSS（稀釋至100 U/ml）,。置于冰上,。
2. 將22G針頭連接在10ml的注射器上，充滿100 U/ml的膠原酶,。將10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培養(yǎng)皿中,。
3. 取另外一個(gè)直徑100mm的培養(yǎng)皿進(jìn)行操作。一只手拿鑷子，另一只手拿注射器,，拇指放在活塞上,。用鑷子夾住小鼠脾臟，用針頭刺入脾臟被膜的狹窄邊緣,，注入100 U/ml膠原酶100ml,。用鑷子將脾臟推向針頭，使針頭前進(jìn)幾毫米,。重復(fù)注射膠原酶,，繼續(xù)直到1ml膠原酶都注射入脾臟，針頭從另一端刺穿脾臟,。
4. 用針頭撕開(kāi)脾臟,，將其轉(zhuǎn)移至含膠原酶的培養(yǎng)皿中（步驟2）。重復(fù)操作,，直到所有脾臟都注射和撕開(kāi),。
5. 從第二個(gè)培養(yǎng)皿中收集細(xì)胞懸液加入到置于冰上的50ml離心管中。用3ml 100 U/ml的膠原酶漂洗培養(yǎng)皿后加到上述50ml離心管中,。
6. 加入3ml 100 U/ml膠原酶至培養(yǎng)皿中,。將撕碎的脾臟依次轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿。用2個(gè)鑷子將它們撕成邊長(zhǎng)1mm的小碎塊,，使其能通過(guò)5ml吸管的內(nèi)徑,。當(dāng)所有的脾臟都撕碎后，將先前放置脾臟碎塊的培養(yǎng)皿中的膠原酶溶液加入進(jìn)來(lái),，用5ml吸管猛烈吹打多次,。
7. 傾斜培養(yǎng)皿，將大塊碎片除開(kāi),，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至第5步的置于冰上的50ml離心管中,。用幾毫升100 U/ml的膠原酶洗滌培養(yǎng)皿后加入至離心管中。
8. 在培養(yǎng)皿留下的脾臟碎塊中加入10ml 400 U/ml的膠原酶,。吹打數(shù)次后于培養(yǎng)箱里放置30-90min,。
9. 在孵育的zui后階段，猛烈吹打碎片,，將其吸至直徑100mm培養(yǎng)皿的無(wú)菌鋼網(wǎng)上,。
10. 用鑷子固定鋼網(wǎng)一端，用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌碎塊,，然后用無(wú)菌的5ml注射器活塞碾磨碎塊,。搗爛直到所有的紅色物質(zhì)從組織中去除。再用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌鋼網(wǎng),。
11. 將鋼網(wǎng)從培養(yǎng)皿中拿開(kāi),，丟棄無(wú)色的黏附的被膜碎塊,。猛烈地吹打培養(yǎng)皿中的液體，將其轉(zhuǎn)移至步驟7的50ml離心管里,。用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌培養(yǎng)皿后一同加入到離心管中（約有0.5%為樹(shù)突細(xì)胞或者更少）,。
12. 如果需要，即可用高密度的BSA離心,。
附錄：
抗體偶聯(lián)的綿羊紅細(xì)胞（EA）：
以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細(xì)胞（Alsever液中提?。籆ocalico）3次,，每次洗滌后均以350g離心5min,。然后用新鮮PBS稀釋為5%細(xì)胞懸浮液（109個(gè)細(xì)胞/ml）。將高致敏的兔抗紅細(xì)胞血清于5%細(xì)胞懸液以1：50稀釋?zhuān)赡苄纬蓙喣瘎┝康目贵w）,。室溫下孵育2h,，偶爾溫和地顛倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗滌形成的EA3次,，隨后以PBS將EA稀釋為5%細(xì)胞懸液,。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗滌一次,。
RPMI-5*培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基（Life Technologies）,，含有：
5%FBS，56℃熱滅活1h
10mmol/L HEPES
20mg/ml硫酸慶大霉素（Life Technologies）
50mmol/ml 2-ME
過(guò)濾除菌
高密度BSA溶液：
在1L容量瓶中,，加入186ml PBS,，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作,，注意液體不要再瓶?jī)?nèi)飛濺）,。不要攪拌，將106g BSA（Cohn fraction V,，推薦采用*BSA）鋪在溶液表面,，蓋上錫紙，冷藏過(guò)夜,，使BSA慢慢溶解,。
第二天，溫和搖晃已變?yōu)槌吻?、微褐色的溶液,；測(cè)量折射指數(shù)，到小數(shù)點(diǎn)后第四位,。25℃條件下,，正確密度的BSA（1.080g/ml）的折射指數(shù)在1.384-1.385,。為校正折射指數(shù)后,，用試紙檢測(cè)pH,。pH應(yīng)在7.0-7.4，一般無(wú)需調(diào)整,。
無(wú)菌過(guò)濾溶液,。將47mm濾膜（Millpore type）置于一個(gè)500ml的過(guò)濾裝置（Nalgene#156-4045）頂部，先以少量BSA潤(rùn)濕濾膜,。真空抽濾數(shù)分鐘,，直到BSA濾出為止。取下真空泵,，小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲(chǔ)存器中（避免起泡沫,。使用真空泵和濾器過(guò)濾剩余的BSA，≥10min）,。4℃可保存3個(gè)月,。
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