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小鼠脾臟樹突細(xì)胞的分離－膠原酶消化制備脾臟細(xì)胞懸液
輔助方案：
膠原酶消化制備脾臟細(xì)胞懸液
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 4000U/ml膠原酶D,，融化后置于冰上
2. HBSS,，已滅菌,，含Ca+,、Mg2+（購置于Life Technologies）
3. 小鼠脾臟
4. 皮下注射針,，22G×11/2in內(nèi)徑（Becton Dickinson）
5. 10ml,、5ml一次性注射器（如Becton Dickinson）
6. 100mm直徑培養(yǎng)皿（如Falcon）
7. 2個(gè)高壓滅菌鍋的鋸齒狀解剖鑷（如Roboz）
8. 高壓滅菌的不銹鋼網(wǎng)：將40目的不銹鋼網(wǎng)剪成5cm×5cm的小方格,，向下折疊邊緣，然后將四邊彎成淺的矩形碗,；錫箔紙包裹后高壓滅菌,。
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 將2管1ml的4000U/ml膠原酶D稀釋（足夠用于20個(gè)脾臟）：1ml加入9ml HBSS（稀釋至4000U/ml,，步驟8使用），1ml加入39ml的HBSS（稀釋至100 U/ml）,。置于冰上。
2. 將22G針頭連接在10ml的注射器上,，充滿100 U/ml的膠原酶,。將10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培養(yǎng)皿中。
3. 取另外一個(gè)直徑100mm的培養(yǎng)皿進(jìn)行操作,。一只手拿鑷子,，另一只手拿注射器，拇指放在活塞上,。用鑷子夾住小鼠脾臟,，用針頭刺入脾臟被膜的狹窄邊緣，注入100 U/ml膠原酶100ml,。用鑷子將脾臟推向針頭,，使針頭前進(jìn)幾毫米。重復(fù)注射膠原酶,，繼續(xù)直到1ml膠原酶都注射入脾臟,，針頭從另一端刺穿脾臟。
4. 用針頭撕開脾臟,，將其轉(zhuǎn)移至含膠原酶的培養(yǎng)皿中（步驟2）,。重復(fù)操作，直到所有脾臟都注射和撕開,。
5. 從第二個(gè)培養(yǎng)皿中收集細(xì)胞懸液加入到置于冰上的50ml離心管中,。用3ml 100 U/ml的膠原酶漂洗培養(yǎng)皿后加到上述50ml離心管中。
6. 加入3ml 100 U/ml膠原酶至培養(yǎng)皿中,。將撕碎的脾臟依次轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿,。用2個(gè)鑷子將它們撕成邊長1mm的小碎塊，使其能通過5ml吸管的內(nèi)徑,。當(dāng)所有的脾臟都撕碎后,，將先前放置脾臟碎塊的培養(yǎng)皿中的膠原酶溶液加入進(jìn)來，用5ml吸管猛烈吹打多次,。
7. 傾斜培養(yǎng)皿,，將大塊碎片除開，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至第5步的置于冰上的50ml離心管中,。用幾毫升100 U/ml的膠原酶洗滌培養(yǎng)皿后加入至離心管中,。
8. 在培養(yǎng)皿留下的脾臟碎塊中加入10ml 400 U/ml的膠原酶。吹打數(shù)次后于培養(yǎng)箱里放置30-90min,。
9. 在孵育的zui后階段,，猛烈吹打碎片,，將其吸至直徑100mm培養(yǎng)皿的無菌鋼網(wǎng)上。
10. 用鑷子固定鋼網(wǎng)一端,，用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌碎塊,，然后用無菌的5ml注射器活塞碾磨碎塊。搗爛直到所有的紅色物質(zhì)從組織中去除,。再用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌鋼網(wǎng),。
11. 將鋼網(wǎng)從培養(yǎng)皿中拿開，丟棄無色的黏附的被膜碎塊,。猛烈地吹打培養(yǎng)皿中的液體,，將其轉(zhuǎn)移至步驟7的50ml離心管里。用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌培養(yǎng)皿后一同加入到離心管中（約有0.5%為樹突細(xì)胞或者更少）,。
12. 如果需要,，即可用高密度的BSA離心。
附錄：
抗體偶聯(lián)的綿羊紅細(xì)胞（EA）：
以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細(xì)胞（Alsever液中提??；Cocalico）3次，每次洗滌后均以350g離心5min,。然后用新鮮PBS稀釋為5%細(xì)胞懸浮液（109個(gè)細(xì)胞/ml）,。將高致敏的兔抗紅細(xì)胞血清于5%細(xì)胞懸液以1：50稀釋（可能形成亞凝集劑量的抗體）。室溫下孵育2h,，偶爾溫和地顛倒溶液,。用RPMI1640（Life Technologies）洗滌形成的EA3次，隨后以PBS將EA稀釋為5%細(xì)胞懸液,。于4℃保存2周,，使用前再以RPMI洗滌一次。
RPMI-5*培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基（Life Technologies）,，含有：
5%FBS,，56℃熱滅活1h
10mmol/L HEPES
20mg/ml硫酸慶大霉素（Life Technologies）
50mmol/ml 2-ME
過濾除菌
高密度BSA溶液：
在1L容量瓶中，加入186ml PBS,，29ml 1mol/L NaOH,，65ml水（小心操作，注意液體不要再瓶內(nèi)飛濺）,。不要攪拌,，將106g BSA（Cohn fraction V，推薦采用*BSA）鋪在溶液表面,，蓋上錫紙,，冷藏過夜，使BSA慢慢溶解,。
第二天,，溫和搖晃已變?yōu)槌吻?、微褐色的溶液；測(cè)量折射指數(shù),，到小數(shù)點(diǎn)后第四位,。25℃條件下，正確密度的BSA（1.080g/ml）的折射指數(shù)在1.384-1.385,。為校正折射指數(shù)后,，用試紙檢測(cè)pH。pH應(yīng)在7.0-7.4,，一般無需調(diào)整,。
無菌過濾溶液,。將47mm濾膜（Millpore type）置于一個(gè)500ml的過濾裝置（Nalgene#156-4045）頂部,，先以少量BSA潤濕濾膜。真空抽濾數(shù)分鐘,，直到BSA濾出為止,。取下真空泵，小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲(chǔ)存器中（避免起泡沫,。使用真空泵和濾器過濾剩余的BSA,，≥10min）。4℃可保存3個(gè)月,。
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