一、實驗?zāi)康?/strong>
學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖電泳法鑒定DNA的原理和方法,。
二,、實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳是用于分離,、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法,。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性,，但不帶電荷,，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷,，在電場中通過凝膠介質(zhì)向正極移動,，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場中的泳動速率液不同,。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡(luò)合物,，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶,，達(dá)到分離,、鑒定分子量，篩選重組子的目的,。
三,、實驗材料
實驗14提取的DNA樣品，
四,、器具及藥品
    電泳儀,，電泳槽,，紫外透射反射儀，恒溫水浴鍋,，微波爐,，微量進樣器，三羥甲基氨基甲烷,，鹽酸,，醋酸鈉，EDTA,，瓊脂糖,，溴酚藍(lán)，溴化乙錠,。
五,、實驗步驟
1、安裝電泳槽
將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈,，晾干,，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺上,，插上樣品梳,。
2、瓊脂糖凝膠的制備
稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中,，（按0.3-1.5%的瓊脂糖含量,，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠,，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠）置微波爐或沸水浴中加熱至*溶化（不要加熱至沸騰）,，取出搖勻。
3,、灌膠
   將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上,。
4、待瓊脂糖膠凝固后,，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液,，然后拔出梳子。
5,、加樣
   將DNA樣品與加樣緩沖液按4：1混勻后,，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加10-20μl,，記錄樣品的點樣次序和加樣量,。
6、電泳
   安裝好電極導(dǎo)線，點樣孔一端接負(fù)極,，另一端接正極,，打開電源，調(diào)電壓至3-5V/cm,，電泳1-3hr,，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1-2cm時，停止電泳,。
7,、染色和觀察
   取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min,，即可在254nm的紫外燈下觀察,，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶,，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜,。溴化乙錠是致癌劑，操作時要小心,，必須戴手套,。
 
附：
⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制(1000ml)：
Tris  54g，硼酸27.5g,，0.5mol/LEDTA20ml,，將pH調(diào)到8.0，定容至1000ml,，4℃冰箱保存,，用時稀釋10倍。
⑵加樣緩沖液的配制：
0.25%溴酚藍(lán),，40%（W/V）蔗糖水溶液,，4℃冰箱保存。
⑶溴化乙錠的配制：
    稱取0.1g溴化乙錠,，溶于10ml水，配成終濃度為10mg/ml的母液,，4℃冰箱保存,。染色時，吸取12.5μl的母液,，加入250ml的水中,，使其終濃度為0.5μg/ml，混合均勻,。
⑷100倍TE緩沖液的配制：
1mol/LTris-HCl（pH8.0）,，100mmol/LEDTA
稱取Tris121.1g，EDTA-Na₂37.23g，先用800ml雙蒸水,，加熱攪拌溶解后,，再用鹽酸調(diào)pH至8.0（大約加入鹽酸20ml），然后定容至1000ml,。
⑸100倍電泳緩沖液的配制：
4mol/LTris-HCl（pH8..0）,，2mol/L醋酸鈉，200mmol/LEDTA
稱取Tris242.2g,，無水乙酸鈉82.03g,，EDTA-Na₂37.23g，先用400ml雙蒸水加熱攪拌溶解后,，再用冰乙酸調(diào)pH至8.0（大約加入冰乙酸50ml）,，然后定容至500ml。用時稀釋100倍,。