Western blotting實(shí)驗(yàn)步驟

1．蛋白質(zhì)的樣品制備：

取心肌組織50mg，待組織塊自行溶解,，用濾紙吸去其表面水分,，將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位，用組織剪盡量將其剪碎,，將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF）,，將玻璃勻漿器插入冰中,，勻漿約30分鐘。

將心肌組織勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中,，4℃12000g離心5分鐘,，收集上清（如有粘稠物進(jìn)一步用超聲處理）,，樣品分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/span>

2 .測定蛋白濃度：

2.1 按50：1配置BCA工作液。

2.2 10ulC液（蛋白標(biāo)準(zhǔn)）+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,。

2.3 分別以0,、1、2,、4,、8、12,、16,、20ul將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液加入96孔板的第1~8標(biāo)準(zhǔn)孔中，在其他樣品孔中加入10ul待測樣品,。

2.4 分別加PBS定容至20ul,。

2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時(shí),。

2.6 用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度：測定A562,，依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白濃度。

3  SDS-PAGE電泳：

3.1 制 膠: 按比例配制分離膠,，緩緩地?fù)u動(dòng)溶液,，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,，再在液面上小心注入一層水,，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，靜置40min,。同前按比例配制濃縮膠,，但混勻溶液時(shí)不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分,，連續(xù)平穩(wěn)的注入凝膠溶液,，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制60min以上以保證*聚合,。

3.2 預(yù)電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,，小心拔去梳子，加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預(yù)電泳20-30min,。（目的是清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),， 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通）。

3.3 樣品準(zhǔn)備：首先計(jì)算上樣體積,，然后按樣品：上樣buffer=4：1的比例加入上樣bufer混勻,，沸水煮10分鐘，冰上5分鐘,。

3.4 加 樣： 預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）和待分析樣品,。（加樣時(shí)間要盡量短,，以免樣品擴(kuò)散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng),。每個(gè)泳道加5ul,。

3.5 電 泳： 加樣完畢，選擇80V恒壓進(jìn)行電泳,，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿到達(dá)兩膠交界處（一般約20分鐘）,，更換至100V恒壓電泳，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處,，即停止電泳（一般約為1小時(shí)20分鐘）,。

4．轉(zhuǎn) 膜：

4.1 切膠：將電泳完畢的膠完整的放在盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中，將目的蛋白所在區(qū)域切下來,，測量其長寬,，并記錄。

4.2 剪膜和濾紙：按膠的尺寸剪膜和濾紙（濾紙長寬較凝膠小0.5~1mm,，PVDF膜長寬較凝膠大0.5~1mm）,，濾紙浸入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中10秒鐘，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒鐘,，然后將兩者都放入盛有去離子水的玻璃皿中3分鐘,，進(jìn)一步放入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中3分鐘。

4.3 向電轉(zhuǎn)槽中倒入部分電轉(zhuǎn)液,，將海綿浸入,。按如下順序制作“三明治”（注意避免兩邊濾紙相互接觸，以免發(fā)生短路）,。從正極到負(fù)極按如下順序排列：正極-海綿-雙層濾紙-PVDF膜-凝膠-雙層濾紙-海綿-負(fù)極,。（其中不能留有氣泡）卡緊轉(zhuǎn)膜板，電轉(zhuǎn)槽中倒?jié)M電轉(zhuǎn)液,，將轉(zhuǎn)膜板浸入電轉(zhuǎn)槽中,，注意正負(fù)極要正確。插上電源,，設(shè)定恒流20mA轉(zhuǎn)膜,，4℃冰箱中。

5,、膜的封閉: 用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次,。放入5%脫脂奶粉封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng),，70轉(zhuǎn)/分鐘,，室溫封閉1小時(shí)30分鐘。

6,、一抗孵育：

6.1 配制一抗：按相應(yīng)抗體的效價(jià)加入一抗稀釋液,，一抗稀釋液按0.05% TBST（ml）：脫脂奶粉（g）=20：1配制。

6.2一抗孵育：將封閉后的膜放入雜交袋中,，加入一抗約1ml,，室溫?fù)u床（70轉(zhuǎn)/分鐘）孵育1小時(shí)30分鐘。

6.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次,。

7,、二抗孵育：

7.1 配制二抗：按相應(yīng)抗體的效價(jià)加入二抗稀釋液，二抗稀釋液按0.05%TBST（ml）：脫脂奶粉（g）=20：1配制,。

7.2 二抗孵育：將一抗孵育后的膜放入二抗中,，室溫?fù)u床（70轉(zhuǎn)/分鐘）孵育1小時(shí)30分鐘。

7.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次,。

8,、ECL顯色

8.1 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制。

8.2 按膜：工作液=10cm2：1ml的比例將ECL工作液覆蓋到膜表面,，放置1~2分鐘后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察,、拍照。

我們的實(shí)驗(yàn)過程如下：

 電泳： SDS-PAGE; 預(yù)電泳 恒壓55 V 20 min,，上樣25 ul, 恒壓55 V 40 min左右,，當(dāng)樣品至分離膠面時(shí)，恒壓75 V,，到考馬斯亮藍(lán)至底部,，停止電泳。

轉(zhuǎn)?。褐谱鬓D(zhuǎn)印三明治,，150 mA。8%-90 min,10%-80min,12%-50min,。中止轉(zhuǎn)印,有條件可以利用麗春紅檢測總蛋白轉(zhuǎn)印是否成功,。

封閉：將轉(zhuǎn)印膜取出，用去離子水清洗,，TBST洗一次5 Min后,，加入5%的脫脂牛奶封閉，于28度封閉2小時(shí),。(注意封閉液,，一抗稀釋液，二抗稀釋液均含有脫脂牛奶,，可以配成含0.01%硫柳汞的溶液以免牛奶變質(zhì))

 洗膜1次,，10 min，

 一抗孵育：一抗?jié)舛?：100（2.5%牛奶抗體稀釋液）,，4度孵育隔天

 洗膜4次,，每次15 min

 二抗孵育：二抗?jié)舛?：3000（2.5%牛奶抗體稀釋液）,，28度孵育1.5-2 H

 洗膜4次，每次15 min（建議洗膜完畢后,，不要立刻顯色,，靜置或者輕搖1.5h-2h后再顯色）

顯色：注意顯色時(shí)間的控制和曝光時(shí)間的控制

祝您工作順利，實(shí)驗(yàn)順利,！