一.分光光度計的一般原理：

分光光度計是利用分光光度法，通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度,，對該物質(zhì)進行定性和定量分析,。

不同種類的分光光度計的基本原理相似，都是利用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源,。光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收，通過測量樣品的吸光值,，經(jīng)過計算可以轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

二.分光光度計有哪些不同的類型,，不同種類的應(yīng)用領(lǐng)域的區(qū)別：

分光光度計有哪幾種不同的分類方式：

1.分光光度計按照波長及應(yīng)用領(lǐng)域的不同可以分為：

(1)可見光分光光度計：測定波長范圍為400～760 nm的可見光區(qū),；

(2)紫外分光光度計：測定波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū)；

(3)紅外分光光度計：測定波長范圍為大于760nm的紅外光區(qū),；

(4)熒光分光光度計：用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜,；

(5)原子吸收分光光度計：光源發(fā)出被測的特征光譜輻射，被經(jīng)過原子化器后的樣品蒸氣中的待測元素基態(tài)原子所吸收,，通過測定特征輻射被吸收的大小,，來求出被測元素的含量。

2.分光光度計按自動化程度分類：可分為手動,、半自動,、自動分光光度計。

3.分光光度計按軟件可分為：帶掃描,、不帶掃描,。

三.分光光度計常見的用途：

1.核酸的定量

核酸的高吸收峰的吸收波長260 nm。利用260nm的波長可以定量測量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA的濃度,。

除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度。如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA),。如果比值低于1.8 或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。

A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。

A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。

2.蛋白質(zhì)的直接定量

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式,，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。

3.細菌細胞密度

細菌培養(yǎng)過程中，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度,。

OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法,。在600nm波長下，以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，測量定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。

四.幾種常見的分光光度計的用途的區(qū)別：

(1)可見分光光度計

用來測量待測物質(zhì)對可見光(400～760nm)的吸光度并進行定量分析的儀器，稱為可見分光光度計,?？稍?00nm測定細菌細胞密度。

(2)紫外可見分光光度計

紫外可見光譜儀用來測量待測物質(zhì)對可見光或紫外光(200～760nm)的吸光度并進行定量分析的儀器,?？梢詼y定核酸和蛋白的濃度，也可以測定細菌細胞密度,。

紫外分光光度計又可分為單光束,假雙光束,雙光束,。它們的用途又有區(qū)別。

單光束：適于在給定波長處測量吸光度或透光度,，一般不能作全波段光譜掃描,，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。

雙光束：自動記錄,，快速全波段掃描,。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響,，特別適合于結(jié)構(gòu)分析,。儀器復(fù)雜，價格較高,。

假雙光束也就是比例雙光束,，它的原理是由同一單色器發(fā)出的光被分成兩束，一束直接到達檢測器,，另一束通過樣品后到達另一個檢測器,。這種儀器的優(yōu)點是可以監(jiān)測光源變化帶來的誤差，但是并不能消除參比造成的影響,。

(3)紅外分光光度計

一般的紅外光譜是指大于760nm的紅外光譜,，這是研究有機化合物常用的光譜區(qū)域,，能分析各種狀態(tài)(氣,、液,、固)的試樣,。

紅外光譜法的特點是：快速,、樣品量少(幾微克-幾毫克),，特征性強(各種物質(zhì)有其特定的紅外光譜圖),、能分析各種狀態(tài)(氣,、液,、固)的試樣以及不破壞樣品。

(4)熒光分光光度計

熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器,。應(yīng)用于科研,、化工、醫(yī)藥,、生化,、環(huán)保以及臨床檢驗、食品檢驗,、教學(xué)實驗等領(lǐng)域,。

通過對這些參數(shù)的測定, 不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化,，從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,。

(5)原子吸收分光光度計

該法主要適用樣品中微量及痕量組分分析常規(guī)儀器之一。是材料分析及質(zhì)量控制部門進行常量,、微量金屬(半金屬)元素分析的有力工具,。