關(guān)于高速離心機(jī)分離的“那點(diǎn)事”

    近有很多客戶打來長沙維爾康湘鷹公司來咨詢關(guān)于離心機(jī)的離心特點(diǎn)以及離心方法,，為此,，維爾康湘鷹技術(shù)人員立即現(xiàn)場(chǎng)為大家答疑。

制備型超高速離心機(jī)有以下幾種分離方法：

　　A.差速離心：逐次增加離心力,，每次可沉降樣品溶液中的一些組份,。

差速離心是一種常用的方法,。在這種方法中，離心管在開始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液,。通過在一定速度下一定時(shí)間的離心后,，就可得到兩個(gè)部份：沉淀和上清液。

　　通常在*次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉,。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中,。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來,。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng),，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對(duì)于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心,，直到達(dá)到所需要的分離純度為止,。

　　差速離心的特點(diǎn)是操作簡單，但分離純度不高,。

　　B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離,，具有很好的分辨率。

    (1)速率區(qū)帶法(ratezonal)：

根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S),。大致步驟如下：

　　在離心管中裝入密度梯度溶液,，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。

　　將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部,。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。

　　由于不同大小的粒子在離心力作用下,，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣,，所以經(jīng)過離心后會(huì)形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

　　注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度,。離心過程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止,。

　　(2)等密度離心法(isopycnic)：

　　根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中,，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶,。

　　密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中,。經(jīng)離心后,，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。

　　注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定,，與時(shí)間無關(guān),，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對(duì)位置,。

　　密度梯度分析法

　　(1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：

　　A,、應(yīng)具備的性質(zhì)：

　　梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：

　　所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。

　　具有某些性質(zhì),，如折射率,，據(jù)此可測(cè)定它的濃度，所形成的溶液粘度低,，不損傷所分離的樣品,，離心分離后容易除去，不妨礙分離積分的分析,。

　　B,、常用介質(zhì)種類：

    常用梯度材料在20℃密度

　　C.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍：

　  等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用

　  各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度

　　(2)、梯度溶液的準(zhǔn)備：

　　計(jì)算,稀釋

　　(3)梯度形狀

　　梯度形狀分：線型,、等速型,、階梯型、平坦型,、陡峭型指數(shù)梯度,。

　　梯度形狀對(duì)于分離是否成功非常重要：

　　常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì),、酶,、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度適用于分離整細(xì)胞,、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動(dòng)物病毒或昆蟲病毒,。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力，適用于分離核糖體亞基,、多核糖體及植物病毒,。

　　B.梯度柱制備：

　　梯度液柱可以用手工或梯度儀制備

　　半注法：

　　為縮減離心時(shí)間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì),，中間加樣品,，上面鋪Buffer或液體石臘油。

　　(4)加樣方法與加樣量：

　　將樣品加到梯度液柱上,，針尖和離心管成45-60°角度,，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對(duì)于DNA一類易斷的脆弱樣品,，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭,，以避免剪切力對(duì)樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱小密度的1/10(W/W),。

　　(5)轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：

　　(6)分離區(qū)帶的回收及檢測(cè)

　　離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：

　　a.穿刺法

　　穿刺離心管底部,，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂,，可控制滴出速度,。

　　b.虹吸法：

　　將一毛細(xì)管輕輕插入管底,，盡量防止梯度抖動(dòng)，用微量泵逐漸滴取,，以一定量滴數(shù)或體積部分收取,。

　　c.加壓法：

　　通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液,。

　　d.切割法：

　　采用的切割刀切割所需區(qū)帶,。

　　區(qū)帶檢測(cè)：

所謂區(qū)帶檢測(cè)，實(shí)際上是對(duì)水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測(cè),，通常只是測(cè)量在260或280mm時(shí)長的吸收值,，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布，這個(gè)操作通常稱之為在線(online)監(jiān)測(cè),。

    如果以上內(nèi)容還不能滿足您對(duì)離心機(jī)的好奇,，您還可以長沙維爾康湘鷹離心機(jī)，我們會(huì)有專業(yè)離心機(jī)專家為您解答,。