. 在western實(shí)驗(yàn)中,，通常有人采用TBS,，有人采用PBS，在使用中有什么區(qū)別,？
選擇合適的緩沖液對(duì)于維持一定PH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性是很重要的,。PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS（因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過(guò)PBS易污染）,。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液,，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽(yáng)離子緩沖液TBS,；陽(yáng)離子交換層析時(shí),，陰離子緩沖液則PBS。
western blot中使用TBS和PBS均可,，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度,。

2. 沒(méi)有注明可以用來(lái)做western blot的一抗，可以用來(lái)做western blot嗎,？
不一定,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線(xiàn)性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的,，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于western blotting，因?yàn)樵趙estern blotting中抗體識(shí)別的是*變性的蛋白質(zhì)抗原,，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞,。

3. 做western每次只加一種一抗，可以同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？
還是不要同時(shí)加兩種一抗,。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話(huà),，就說(shuō)不清楚了。做Western在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照,，也是先上目的蛋白的一抗,、二抗，ECL顯色,、壓片,、洗片；漂洗以后,，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗,，ECL顯色,、壓片、洗片,。

4. western blot 使用的膜哪種啊,，PVDF好還是NC膜，如何選擇,？
PVDF膜價(jià)格較貴,，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡,，結(jié)合能力較強(qiáng),，但價(jià)格比較昂貴。 NC膜價(jià)格比較便宜,，應(yīng)用較廣,，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF,，不能重復(fù)使用,，但蛋白吸附容量高，親水性較好,。 都可以用麗春紅染色,。具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn)。

5. 為什么出現(xiàn)了多條帶,每個(gè)加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶,，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時(shí)間不夠嗎,？做WESTERN必須要內(nèi)參嗎？
一抗,、或二抗抗體濃度太高,，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強(qiáng)，目的蛋白經(jīng)過(guò)處理后發(fā)生變化,而內(nèi)參的條帶基本均勻一致.這樣才有說(shuō)服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴(yán)格意義上說(shuō),內(nèi)參是必須做的,。
6. western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些,？用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？

作為western來(lái)講,，理論上單抗比多抗的特異性要好,，但單抗種類(lèi)較少一般價(jià)格偏高，所以一般來(lái)說(shuō)多抗足夠了,。用于western的抗體和用于ELISA的抗體,，一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類(lèi),，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性,，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)確定,。
做免疫印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問(wèn)題,，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶,。

7. 半干轉(zhuǎn)是否要求膜,，濾紙，膠同樣大??？因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn),，那樣會(huì)不會(huì)短路,？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢,？

可以相等,，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了,，上下兩層慮紙也不能因過(guò)大而相互接觸,，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和慮紙,。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行,，正常的半干是慢慢變高的， zui后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的,。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路,。

8. Western Blot哪種染色好？
（1） 陰離子染料是較常用的,，特別是氨基黑,，脫色快,，背景低檢測(cè)極限可達(dá)到1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度,，但脫色慢,，背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ,，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析,。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膜,。靈敏度低,。
（2） 膠體金，靈敏度高,，檢測(cè)范圍可到pg級(jí),，但染色比穩(wěn)定。
（3） 生物素化靈敏度位于1,、2之間,，可用于任何一種膜。

9. 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上,， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）（優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液,，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》）,，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力,，甲醇可以防止凝膠變形,，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率,；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）,；使用戊二醛交聯(lián),；低濃度膠，如低至6％,。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠,；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間,。

10. DAB顯色,、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？
DAB顯色在辣根過(guò)氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物,，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑,，DAB的氧化還能引起聚合作用,，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中,，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類(lèi)和磷酸,。酚和無(wú)色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料,。

11. 酶顯色與熒光顯色之間,，各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？
免疫酶技術(shù)就是用酶（如辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記已知抗體（或抗原）,，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng),，如果組織中含有相應(yīng)抗原（或抗體），抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時(shí),，能催化底物水解,、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng),，這樣就可以識(shí)別出標(biāo)本抗原（抗體）分布的位置和性質(zhì),，通過(guò)圖像分析并可達(dá)到定量的目的。
免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷,，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存,，對(duì)組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足,，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法,，對(duì)石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為免疫病理研究開(kāi)辟了一條新途徑,，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度,，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù),，前者是將酶通過(guò)交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上,，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的免疫反應(yīng),，稱(chēng)為非標(biāo)記抗體酶技術(shù),。