紫外分光光度法測定DNA蛋白質(zhì)含量

美析儀器有限公司

一,、實驗目的

? 學習紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理;

? 掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術;

? 掌握UV-1700紫外可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。

二,、實驗原理

紫外可見吸收光譜法又稱紫外可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜,，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為基礎而建立起來的一類分析方法,。紫外可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜.

定性分析:利用紫外可見吸收光譜法進行定性分析一般采用光譜比較法,。即將未知純化合物的吸收光譜特征,，如吸收峰的數(shù)目、位置,、相對強度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進行比較,。

定量分析: 紫外可見吸收光譜法進行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時,，在一定濃度范圍內(nèi),，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度成線形關系,。因此,，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量,。由于zui大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)zui大,，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得zui大靈敏度,。

光度分析時,，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為b的兩個吸收池中，讓一束一定波長的平行單色光非別照射空白和待測溶液,，以通過空白溶液的透光強度為I0,，通過待測溶液的透光強度為I，根據(jù)上式,，由儀器直接給出I0與I之比的對數(shù)值即吸光度,。

紫外可見分光光度計:紫外可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計，它的主要部件有五個部分組成,，即光源,、單色器、吸收池,、檢測器,、信號顯示器;

由光源發(fā)出的復合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產(chǎn)生光電流,，產(chǎn)生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度A,。可見光區(qū)采用鎢燈光源,、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源,、石英吸收池。

本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量,。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,，因此,，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其zui大吸收峰位于280 nm附近(不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別),。在zui大吸收波長處,，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性,，且穩(wěn)定性好,，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點,。

三,、儀器與試劑

UV-1700美析儀器-紫外可見分光光度計，比色管,，吸量管 標準蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液 0.9% NaCl溶液,，待測蛋白質(zhì)溶液

四、實驗步驟

〈一〉準備工作

啟動計算機,，打開主機電源開關,，啟動工作站并初始化儀器。

在工作界面上選擇測量項目(光譜掃描,，光度測量),，本實驗選擇光度測量，設置測量條件(測量波長等),。

3. 將空白放入測量池中,，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零,。

4. 標準曲線的制作,。

〈二〉測量工作

1.吸收曲線的繪制：

用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl

溶液稀釋至刻 度,，搖勻,。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比,，在190 nm～400nm區(qū)間,，測量吸光度。

2. 標準曲線的制作：

用吸量管分別吸取0.5,、1.0 ,、1.5、 2.0 ,、2.5 mL 5.00 mg.mL-1標準蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中,，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度,，搖勻,。用1 cm石英比色皿,，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度A278

記錄所得讀數(shù),。

3. 樣品測定：

取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液3 mL,，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平 行測定三份,。

五,、數(shù)據(jù)處理

1. 以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標,，繪制吸收曲線,，找出zui大吸收波長。

由吸收曲線可得zui大吸收波長λmax=278nm(圖略)

2. 以標準蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標,，吸光度為縱坐標繪制標準曲線,。

標準溶液濃度C(mg/mL)

吸光度A 0.25 0.171 0.50 0.335 0.75 0.482 1.00 0.637 1.25

標準溶液濃度C(mg/mL)

y=0.6208x+0.0186R2

=0.9998

濃度C-吸光度A標準曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186

3. 根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標準曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度,。

平行測定次數(shù) 樣品液吸光度A 樣品溶液濃度C(mg/mL)

1 0.676 1.059 2 0.672 1.053 3 0.674 1.056

所測溶液平均濃度: C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL

測量的標準偏差： S=√Σ(Xi-X)2/(n-1)=0.003 

待測蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL,。