蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）,。也有其它型號(hào) 的,、不同體積大小和MWCO超濾管可選,，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積,、濃縮目標(biāo)體積而定,?？芍貜?fù)使用,，使用一次就扔掉太浪費(fèi)。以下是個(gè)人總結(jié)的使用方法和注意事項(xiàng),。

1,、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積,，zui常見(jiàn)的是Ultra-15（10kD）,。到底選擇多大截留分子量比較合適呢？10kDa、 5kDa,、還是30kDa,？通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾 管,。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管,。認(rèn)真閱讀使用說(shuō)明書(shū),，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同，表格中有,。

2,、新買(mǎi)來(lái)的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水,，水量*過(guò)膜,，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,，即可加入蛋白液,，加入的多少，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙€(xiàn)為準(zhǔn),。操作要輕,，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷,。

3,、平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡,。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜,。開(kāi)始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）,。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同,。具體可參閱附件里的說(shuō)明書(shū),。離心機(jī)的加速度調(diào)至zui低檔，減小對(duì)膜的壓力,。注意,，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開(kāi)離心機(jī),，否則離心機(jī)出問(wèn)題時(shí),，無(wú)法*時(shí)間處理，后果不可預(yù)測(cè)！膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）,。在實(shí)際使用中,，一般轉(zhuǎn)速 開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。

4,、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，【取50ul國(guó)產(chǎn)Bradford溶液,，加入10ul流穿,，看有沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要判斷是否漏管,，用5mg/ml的BSA離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)】,，繼續(xù)加入 剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作,，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止,。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾,，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止,。

5,、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候,，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再 濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次,，zui后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以?xún)?nèi)的情況,。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的,。

6,、取出zui終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取,，輕輕順著邊緣插入槍頭,，輕輕吹打、混勻蛋白液,，注意不要碰到超濾膜,，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul,，直到吸完,。管底剩下的zui后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則難度太大,，有可能損壞超濾膜,。zui后加入MilliQ水到超濾管中，沒(méi)過(guò) 超濾膜,，防止膜失水變干,。

7、以下是處理超濾管,，重復(fù)利用超濾管的步驟,。

8、倒出超濾管里的水,，用milliQ水輕輕潤(rùn)洗幾次,，【若管底有可見(jiàn)的蛋白沉淀，可以先加入水,，然后用槍頭吹打,，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起,，然后倒掉,，不可用自來(lái)水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液,，室溫放置20min,，期間平衡超濾管。再離心10min,。倒出殘留的NaOH溶液,，將 管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個(gè)小時(shí),再換新的水,放置幾個(gè)小時(shí)，不斷稀釋NaOH濃度,。50ml管和蓋子用自來(lái)水洗,，內(nèi)壁再用 MilliQ水洗干凈,。

9、取出浸沒(méi)的管芯,，加至接近滿(mǎn)的MilliQ水,，50ml管也加滿(mǎn)MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管,，排出部分水,，然后蓋上蓋子，放4度保存,，直到下次使用,。一般來(lái)說(shuō)，按照上述步驟和注意事項(xiàng),，每根管用三四年不會(huì)壞,。