一,、細胞培養(yǎng)基本概念
　　細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞摹擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境,，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下,，使期生長繁殖,，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個細胞或細胞群,。
　　在醫(yī)學遺傳學研究中應用zui廣泛的是外周血淋巴細胞,、皮膚或纖維細胞和各種能在體外長期生長的細胞系。外周血淋巴細胞培養(yǎng)具有時間短,、技術(shù)簡便,、可重復取材等優(yōu)點，它在臨床染色體分析中使用zui廣泛,。體外培養(yǎng)細胞株可在培養(yǎng)過程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化,，成為*細胞系,，也可直接建成*細胞系,，*細胞系能在體外無取制的傳代和生長。*細胞系通常具有非整倍體細胞和各個細胞的核型不*相同特征,。但細胞克隆的細胞系其這一特征可以不明顯,。
二、細胞培養(yǎng)的環(huán)境
　　細胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細胞基本相同,。
　　1,、無污染環(huán)境
　　培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養(yǎng)時,，與體內(nèi)相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力,，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導致細胞死亡,。因此在進行培養(yǎng)中,，保持細胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等,，是維持細胞生存的基本條件,。
　　2、恒定的溫度
　　維持培養(yǎng)細胞旺盛生長,，必須有恒定適宜的溫度,。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5℃±0.5℃,，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響,，甚至死亡,。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時,，細胞代謝與溫度成正比,；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷,，但仍有可能恢復,；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷,，僅小半數(shù)有可能恢復,；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷,，大部分細胞死亡,，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時,，細胞全部死亡,。
　　3、氣體環(huán)境
　　氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一,，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳,。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分,。開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中,。
　　二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞生長繁殖所需成分,，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值,。大多數(shù)細胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響,。但細胞耐酸性比耐堿性大一些,，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。有資料顯示,，原代羊水細胞培養(yǎng)PH6.8時zui適,。
　　細胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)zui常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2,，但二氧易于逸出,，故zui適用于封閉培養(yǎng)，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細胞無毒性,，也起緩沖作用,，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細胞培養(yǎng)技術(shù)中,，其zui大優(yōu)點是在開放式培養(yǎng)或細胞觀察時能維持較恒定的PH值。
　　4,、細胞培養(yǎng)基
　　培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多,，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類,；按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。
　?。?）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴格配制而成的,。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸,、脂類,、無機鹽、維生素,、微量無素和細胞生長因子等,。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。
　?。?）天然培養(yǎng)基：使用zui普遍的天然培養(yǎng)基是血清,，基本以小牛血清zui普遍。血清由于含有多種細胞生長因子,、促貼附因子及其多活性物質(zhì),。與合志培養(yǎng)基合用，能使細胞碩利增殖生長,。常見使用zui為5-20%,。
三,、細胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件
　　1,、實驗室設(shè)計
　　細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響,。細胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響,，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新,，干燥和無煙塵,。細胞培養(yǎng)工作包括：工作液配制、無菌操作（采樣）,、溫育,、無菌處理，細胞和用品貯存等,。細胞培養(yǎng)室的設(shè)計實施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè),，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室,，而洗刷消毒在另一室。
　　2,、常用設(shè)施及設(shè)備
　?。?）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式,、直流式和外流式三大類,。
　　（2）無菌操作間：一般由更衣間,、緩部間和操作間三部分組成,。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機,、倒置顯微鏡等,。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等,。
　?。?）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機,、水浴鍋,、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品,。
　?。?）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋,、蒸餾水處理器及酸缸等,。
　　（5）分析間：顯微鏡,、計算機及打印機等,。
　　3、培養(yǎng)器皿
　　細胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主,，常準備zui需是使用zui的三倍,。器皿應選擇透明度好、無毒,、中性硬度玻璃制品,。常用的玻璃器皿有下面幾種。
　?。?）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液,、血清等液體，常以500ml,、250ml,、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替,。
　　（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異,，用于細胞傳代培養(yǎng)的細胞要求瓶壁厚簿均勻,，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致,，口徑一般不小于1cm,，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位，規(guī)格有200ml,、100ml,、50ml、25ml,、10ml等幾種,。用于外周血培養(yǎng)的常用10ml普通圓瓶。兩種培養(yǎng)瓶均要求選用玻璃制成,。
　?。?）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm,、60mm,、120mm等幾種。
　?。?）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類,，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管,，刻度吸管用于移動液體,。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管,，分彎頭和直頭兩種,。
　　（5）離心管：離心管是細胞培養(yǎng)中使用zui廣泛的器皿,，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣,，常用于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml,、30ml、15ml,；后者則多為10ml和5ml,。
　　（6）其它：如三角燒瓶,、燒杯,、量筒,、漏斗、注射器等,。
四,、培養(yǎng)細胞形態(tài)
　　體外培養(yǎng)細胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類,。貼附型細胞在培養(yǎng)時能貼附在支技物表面生長,。如羊水細胞為貼附型細胞，常表現(xiàn)為成纖維型細胞和上皮細胞生長,。懸浮型細胞在培養(yǎng)中懸浮生長,。
　　1、成纖維型細胞
　　在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時,，皆可稱之為成纖維細胞,。本型細胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長,，細胞*有卵園形核,，胞質(zhì)向外伸出2-3厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外,，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細胞常呈本類形態(tài)生長,。
　　2、上皮型細胞
　　此類型細胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征,，細胞*有園形核,，細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內(nèi),、外胚層細胞如皮膚,、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養(yǎng)時,，皆呈上皮型形態(tài)生長,。
　　3、游走型細胞
　　本型細胞在支持物上散在生長,，一般不連成片,。細胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動,，速度快且不規(guī)則,。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞區(qū)別,。在一定的條件下,，由于細胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細膩包形態(tài)。常見于羊水細胞培養(yǎng)的早期,。
五,、培養(yǎng)細胞形態(tài)分析
　　培養(yǎng)細胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，zui常見的是貼附于平面支持物細胞,。在一般光鏡下生存中的細胞是均質(zhì)而透明的,，結(jié)構(gòu)不明顯。細胞在生長期常有1-2個核仁在細胞機能狀態(tài)不良時,，細胞輪廓會增強,，反差增大。若胞質(zhì)中時而出現(xiàn)顆粒,、脫滴和腔泡等,，表明細胞代謝不良。
六,、培養(yǎng)用品的清洗與消毒
　　目前我國細胞培養(yǎng)器皿主要仍使用能反復使用的玻璃器皿,，清洗的主要目的為清除雜質(zhì)和微生物，使在器皿內(nèi)不殘留任何影響細胞生長的成份,。因而在組織細胞培養(yǎng)中清洗和消毒是一項極為重要的環(huán)節(jié),。
　　（一） 清洗
　　在組織細胞培養(yǎng)中,，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學物質(zhì),，均能影響培養(yǎng)細胞的生長,。因此對新使用和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴格*的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同,，選擇不同的清洗方法,。
　　1、玻璃器皿的清洗
　　組織細胞培養(yǎng)中,，使用量zui大的是玻璃器皿,，故工作zuizui大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡,、刷洗,、侵酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡,，而且不能殘留任何物質(zhì),。
　　（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,，以使附著物軟化或被溶液掉,。新的初次使用的玻璃器皿,，在生產(chǎn)及運輸過程中,，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵,，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗,，然后用稀鹽酸液（5）浸泡過夜,，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì),，干固后不易洗掉,，故用后要立即浸入水中，且要求*浸入,，不能留有氣泡或浮在液面上,。
　　（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗,，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì),。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度,。
　?。?）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成,，其處理過程稱為浸酸,。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì),。清潔液去污能力很強,。是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時器皿要充滿清潔液,，勿留氣泡或器皿露出清潔液面,。浸泡時間一般為過夜，不應少于6小時,。 清潔液可根據(jù)需要,，配制成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） （A）強清潔液 63 1000 200000 B）次強清洗液 120 200 1000 （C）弱清潔液 100 100 100
　　清潔液配制時應注意安全,，須穿戴耐酸手套和圍裙,，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中,，然后慢慢加濃硫酸,。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā),，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中,，然后慢慢加濃硫酸,。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā),，配制溶液應選擇塑料制品,。配成后清潔液一般為棕紅色。
　?。?）沖洗：玻璃器皿在使用后,，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡,。沖洗用洗滌裝置,。即省力、效果又好,。如用手工操作,，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈,，用蒸餾水清洗3-5次,，晾干備用。
　　2,、膠塞的清洗
　　細胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞,。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應先用自來水沖洗,，再做常規(guī)處理,，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘,，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì),。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘,，晾干備用,。
　　3、塑料制品的清洗
　　塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝,，打開包裝即可用,，多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜,，用自來水充分沖洗,，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，zui后用自來水和蒸餾水沖洗干凈,，晾干備用,。
　　（二）消毒
　　細胞培養(yǎng)的zui大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌,，真菌和病毒等微生物的污染,，污染主要是由于操作者的疏忽而引起,，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不*,，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗,，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染,。
消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線,、濕熱,、過渣等）,。 （B） 化學滅菌法（各種化學消毒劑）。 （C） 抗生素,。
　?。?）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器皿,。紫外線直接照射方便,、效果好，經(jīng)一定的時間照射后,，可以消滅空氣中大部分細菌,，培養(yǎng)室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔,，照射不到的地方起不到消毒作用,。
　　紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣,，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響,，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進行實驗操作,。
　?。?）溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用zui廣泛,、效果的消毒方法,。溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿,，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險,，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前,，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣,，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門,，同時檢驗安全閥活動自如,，繼后開始升壓,，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間,。消毒過程中,，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全,，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生,。
常用物品消毒壓力及時間：
　　培養(yǎng)液、橡膠制品,、10磅10分鐘,；
　　布類、玻璃制品,、金屬器械,、18磅20分鐘。
　　上兩種是zui常見的物理消毒方法,。
　?。?）化學消毒法：zui常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚,，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理,。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?；瘜W消毒法操作簡單,、方便有效。
　?。?）抗生素消毒：確切應記成抗生素滅菌,，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染。