現(xiàn)代液相色譜中,，分離效果好壞的一個重要指標是色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬,，因此，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解,。
    一、硅膠基質(zhì)填料 
    1,、正相色譜,。正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2,，APS）和氰基團（CN,，CPS）的鍵合相填料。
    由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強,，因此,，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱,。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform）,，二氯甲烷（Methylene Chloride）等,。
    2、反向色譜,。反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì),，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強,，通常為水,、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物,。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分zui先被沖洗出,，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。
    常用的反向填料有：C18（ODS）,、C8（MOS）,、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等,。
    二,、聚合物填料。聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,，其重要優(yōu)點是在PH值為1—14均可使用,。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料,，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料,，色譜柱柱效較低。
    三,、其它無機填料,。其它HPLC的無機填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途,。如,，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相,，石墨化碳的表面即是保留的基礎,，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強,。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體,，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用,。氧化鋁也可以用于HPLC,。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床,，其優(yōu)點是可以在PH高達12的流動相中使用,。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應用范圍受到一定限制,，所以未能廣泛應用,。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,，應用PH1-14,，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究,，加之面臨的實驗難度,，其重要用途與優(yōu)勢尚在進行之中。
    怎樣選擇填料粒度,。目前,，商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進行,。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù),，即柱效和背壓。粒度越小,，柱壓越大,，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下,，提高柱效可提高分離度,，但不是*的因素。如果固定相選擇是正確,，但是分離度不夠,，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%,；然而,，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時,，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱,，即相同的塔板數(shù)或分離能力，但是柱長更短,，以縮短分析時間,。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度,，比如用乙腈代替甲醇,，以降低色譜柱的壓力。 

色譜柱維護 
（1）防止色譜柱堵塞 
原因1：溶劑中的不溶物 
 — 應使用色譜純?nèi)軇?，膜過濾（孔徑不超過0.45μm） 
原因2：樣品中的不溶物 
 — 應對樣品進行膜過濾（孔徑不超過0.45μm） 
原因3：泵,，進樣器等中的不溶物 
—  在泵和進樣器之間安裝內(nèi)置過濾器，在進樣器和柱之間安裝預過濾器 
原因4：柱內(nèi)不溶物的形成 
4-1．由于溶劑的不互溶而產(chǎn)生的沉淀 
—用能溶解沉淀物的溶劑沖洗色譜柱 
4-2．在不互溶溶劑中由于進樣而產(chǎn)生的沉淀 
    —檢查樣品液和流動相是否互溶 
4-3．由于溫度的改變或固定相的干涸而產(chǎn)生的沉淀 
—將色譜柱密封緊,，并保持室溫恒定 
操作壓力上升故障排除 
HPLC系統(tǒng)流程圖： 
吸入過濾器>>泵>>內(nèi)置過濾器>>進樣器>>預過濾器>>保護柱>>主分析柱>>檢測器 
和排放系統(tǒng) 
從流程圖的末端依次斷開部件,，如從檢測器開始斷開，zui容易引起阻塞的部件是： 
預過濾器,，保護柱和主分析柱 ,。
[注]：應記錄新柱子在常規(guī)分析條件下的操作壓力 
（2）柱堵塞的修復 
步驟1：使用含鹽緩沖液后（如離子對試劑）應用溶解性強的溶劑（如水）進行沖 
洗 ；
步驟2：先斷開檢測器,，然后用對來自樣品中的物質(zhì)有強溶解性的溶劑進行沖洗,。 
對于反相色譜柱，可使用甲醇,，乙睛,，四氫呋喃，氯仿,，庚烷等,，在此條件下，應 
避免溶劑的pH低于2或高于8,；
若經(jīng)過步驟1和步驟2后,，壓力仍沒下降至步驟3 ,；
步驟3：斷開檢測器，將色譜柱反方向放置,，然后檢查柱壓 
1）若壓力穩(wěn)定下降,，至步驟4 

2）若壓力不下降，至步驟5 
步驟4：保持色譜柱反方向連接,，用低于0.5 ml/min 流速沖洗1小時 
若步驟4不能降壓,，至步驟5 ；
步驟5：若內(nèi)置過濾器被堵塞,，應沖洗或更換,。柱連接端的拆卸或重裝會導致柱效 
下降，（有效塔板數(shù)下降和不對稱峰）,，若步驟5不能降低柱壓,，至步驟6 
步驟6：若進口端的填料發(fā)生堵塞，柱子將不可能被*恢復,，只能通過去掉進口 
端的部分填料,，重新填充進行有限的柱效恢復。（2~5mm） ,；
[注]：在多數(shù)情況下,，柱效將嚴重地下降 
步驟7：若步驟6無法改善柱子性能，那么柱子已無法修復,，請注意當拆開連接端時 
柱子已不再得到質(zhì)量保證,。 
柱效的下降：
導致柱有效塔板數(shù)和分離能力下降的主要原因是固定相的惡化和硅膠表面活性鏈的 
損失，在這些條件下柱子已不可能再恢復

色譜柱的使用

1,、色譜柱的使用說明： 
　?。?）色譜柱使用前注意事項：色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相,。在使用前,，一定要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中,，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑,，應先用10％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出,，堵塞色譜柱,。
　　（2）流動相：流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純,，配流動相的水是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水,。如果將所配得流動相再經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾一次則zui好，尤其是含鹽的流動相。另外,，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應該定期清洗或更換,。
　　以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的PH值適用范圍是2.0-8.0，BDS C18適合于堿性化合物,，PH值適用范圍為2.0-10.0,。當必須要在PH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗,，并*置換掉原來所使用的流動相。
　?。?）樣品：樣品也要盡可能清潔,，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱（SPE）對樣品進行預處理；若樣品不便處理,，要使用保護柱,。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應嚴格脫水,。
　　2,、色譜柱的保存 
　　（1）反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相,，實驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘,。注意：不能用純水沖洗柱子,，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷,。
　?。?）長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下,。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中,，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑*或柳硫汞）中,，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上,。儲存的溫度是室溫。
　　3,、色譜柱的再生 
　　因為色譜柱是消耗品,，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低,，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象,，一般來說可能是柱效下降。
　?。?）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90 （V/V）,，乙腈,，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱,。
　?。?）正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇,、二氯甲烷,、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱,。要注意上述溶劑必須嚴格脫水,。
　　4、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 
　　色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高,，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加,，屬于正常現(xiàn)象,。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外）,，以下列舉了部分常見原因及解決辦法：
　　（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染,；
　　解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭,，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱,。
　?。?）色譜柱頭的填料被樣品污染；
　　解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染,，將柱頭螺絲卸下,，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入,，仔細修復后,，重新安裝上柱頭螺絲。
　?。?）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑,，形成結(jié)晶析出； 解決方法：如確定定是鹽結(jié)晶,，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解,，再換高濃度甲醇。
　　（4）流動相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解,。解決方法：如果因PH值使用不當,，很難恢復 液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成,，其中液相色譜柱的正確安裝和使用,，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路,。
　　一,、液相色譜柱的安裝：
　　1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
　　a,、空柱由柱接頭,、柱管及濾片組裝而成。
　　柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),，柱接頭是兩端螺紋組件,，一端是為7/16英寸外螺紋,，另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化),。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封,。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,，在安裝色譜柱時,，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘,。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應嚴格控制在2．5mm長或其他固定尺寸),。
　　在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng)),，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失,。空柱各組件均為316#不銹鋼材質(zhì),，能耐受一般的溶劑作用,。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意,，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,，以避免腐蝕。
　　b,、柱填料：
　　液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的,，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
　　正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分無定型和球型兩種,，其顆粒直徑在3—10
μm的范圍內(nèi),。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠,。
　　反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì),，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分,。
　　常用的其他的反相填料還有鍵合C8,、C4、C2,、苯基等,，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。
　　2,、色譜柱的安裝：
　　a,、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型,、尺寸,、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
　　b,、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用,。
　　c、 按柱管上標示的流動相流向,，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許,，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接,。連接管是外徑為1.57mm,、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán),。在接管時一定要設法降低柱外死體積,。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,，然后順時針擰緊空心螺釘,，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈,，切記不要用力過大,。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1/4圈,，直至不漏液為止,。
　　二,、液相色譜柱的使用：
　　色譜柱在使用前，進行柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來,，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動相,、柱溫等條件的差異而有所不同；另外,，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是*條件),，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性,。
　　1,、樣品的前處理：
　　a、使用流動相溶解樣品,。
　　b,、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
　　c,、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì),。
　　2、流動相的配制：
　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的,，因此要求流動相具備以下的特點：
　　a,、流動相對樣品具有一定的溶解能力,，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中),。
　　b、流動相具有一定惰性,，與樣品不產(chǎn)生化學反應(特殊情況除外),。
　　c、流動相的黏度要盡量小,，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果,；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度),。
　　d,、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器,，使用對紫外吸收較低的溶劑配制,。
　　e、流動相沸點不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡,，導致實驗無法進行,。
　　f、在流動相配制好后,，一定要進行脫氣,。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用,。
　　3,、流動相流速的選擇：
　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對于一根特定的色譜柱,，要追求*柱效，使用*流速,。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱,，流速0.8ml/min為佳,。
　　當選用*流速時，分析時間可能延長,?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量),。
　　注意：
　　a．由于甲醇廉價,，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
　　b．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相,，沒有提純的己烷不得使用,。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì),，有可能影響分析結(jié)果,。
　　c．含水流動相zui奸在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要隔夜,。加入*,，防止細菌生長。
　　d．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾,，除去微粒雜質(zhì),。
　　e．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,，提高柱性能,。
　　4、柱性能測試：
　　啟動液相色譜儀：a,、流動相流速設定為1ml/min,。
　　b,、UV檢測器波長設定為254nm。
　　使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品,。
　　記錄并計算測試結(jié)果,。

2、色譜柱的保存 

（1）反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：

使用緩沖液或含鹽的流動相,，實驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘,。注意：不能用純水沖洗柱子,，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷,。

（2）長期保存色譜柱：

如色譜柱要長時間保存,，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中,，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中,，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑*或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上,。儲存的溫度是室溫,。

3、色譜柱的再生  

因為色譜柱是消耗品,，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加,，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象,，一般來說可能是柱效下降,。

（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90 （V/V）,，乙腈,，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱,，完成后再以相反順序沖洗色譜柱,。

（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷,、異丙醇,、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱,，然后再以相反的順序沖洗色譜柱,。要注意上述溶劑必須嚴格脫水。

4,、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 

色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高,，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加,，屬于正常現(xiàn)象,。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外）,，可能的原因有如下幾點：

（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；

（2）色譜柱頭的填料被樣品污染,；

（3）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑,，形成結(jié)晶析出；

（4）流動相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解,。

解決辦法如下：

（1）如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭,，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱,。

（2）如確定色譜柱頭的填料被污染,，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料,，用相同的柱填料重新填入,，仔細修復后，重新安裝上柱頭螺絲,。

（3）如確定定是鹽結(jié)晶,，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇,。

（4）如果因PH值使用不當,，很難恢復。