光學(xué)顯微鏡zui重要的部件物鏡的特性介紹

今天和大家談?wù)劰鈱W(xué)顯微鏡當(dāng)中zui重要的部件：物鏡,。為什么是zui重要且沒有之一呢,？因?yàn)榭蒲泄ぷ髡邆冴P(guān)心的解析度,、信噪比等與成像質(zhì)量息息相關(guān)的參數(shù)都是由物鏡決定的,。當(dāng)然，顯微鏡的其他部分也一樣*,，但是篇幅有限,，即便是物鏡，我們也只能淺嘗輒止的談一談,。

 在生命科學(xué)研究領(lǐng)域,，光學(xué)顯微鏡的使用率位列儀器的,，如果有人不相信，那請看看周圍吧,，不管是在實(shí)驗(yàn)室,，還是在醫(yī)院，我們都隨處可見顯微鏡們靚麗的身影,。

而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,，在光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，衍生出許多其他復(fù)雜的成像系統(tǒng),。例如全內(nèi)反射熒光顯微鏡,、激光共聚焦掃描顯微鏡、多光子激光掃描顯微鏡等等,。絕大多數(shù)的科研工作者們,，都需要或多或少的和顯微鏡大家族中的成員們打交道。這個時候,，對這些復(fù)雜系統(tǒng)的了解就有一些迫切了,。

那么作為物鏡當(dāng)中，zui不可不談的東西就是物鏡的zui重要的參數(shù)：數(shù)值孔徑,。

數(shù)值孔徑即Numerical Aperture  所以在中國我們通常稱之為NA值,，NA值的大小直接標(biāo)注在物鏡上，大家平時切換物鏡的時候,，有觀察過嗎,？通常來說NA值越大，物鏡的成像質(zhì)量越好,。為什么會這么說呢,？我們先來看看數(shù)值孔徑的計(jì)算公式：
NA = n (sin µ)
其中n是物鏡與樣本之間介質(zhì)的折射系數(shù)，µ是物鏡孔徑角的一半,。

作為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究者,，我們不必去深究為什么NA的公式是如上所示，但是,，我們需要了解的是為什么NA值是物鏡zui重要的參數(shù),，所以趁熱打鐵，我們再看看下面兩個公式：
R= 1.22λ / [NAObj + NACon]
R = 1.22 • λ/(2 • NA)
上面兩個公式的左邊R,，決定了物鏡的分辨率,，即物鏡可以區(qū)分兩點(diǎn)間的zui短距離。接著我們再看看公式的右邊,，λ是入射光的波長,，實(shí)驗(yàn)條件恒定的情況下，跟數(shù)值一樣都是定制，而我們看到NA都是處在分母的位置上,，即NA值越大,，R的數(shù)值就越小，分辨率就越高,，所以我們觀察樣本的解析度就越高,，通俗點(diǎn)來說，就是可放大的倍率越大,。那么為什么會兩個公式呢,？因?yàn)?個是透射光的計(jì)算公式，另一個是反射光的,。順帶一提的是,，通常來說NACon即聚光鏡的數(shù)值孔徑要小于高倍物鏡的數(shù)值孔徑，所以熒光成像的分辨率要高于明場成像,。

談到反射光，作為現(xiàn)如今zui重要的成像手段,，熒光成像在顯微成像領(lǐng)域毋庸置疑的處在壟斷地位,，這里筆者不得不多談一下她，因此為大家介紹如下公式：
Intensity ∝ (NAobj)4/Mag2
在這個公式中Intensity的大小指的是熒光的強(qiáng)度值,，而NA值這一次出現(xiàn)在了分子的位置,，所以NA值越大，熒光強(qiáng)度越大,，所以得到的熒光圖像信噪比越高,，圖片質(zhì)量越好。如果是進(jìn)行時間序列成像,，高NA值的物鏡,，還能大大減少曝光時間，提高成像速度,，從而更好的捕捉快速移動的熒光標(biāo)記物,。

 綜上所述，雖然較為粗略和淺顯,，但是我們依然可以大致了解NA值的重要性,，同時也對物鏡也有了初步的了解，那么隨之而來的問題就出現(xiàn)了：

NA既然如此重要,，為什么物鏡種類卻如此千差萬別 ,？

既然NA值如此重要，顯微鏡廠商們都只生產(chǎn)高數(shù)值孔徑的物鏡不就好了,？為什么還要生產(chǎn)那么多種類繁多的物鏡呢,？我們再回過來看看NA的計(jì)算公式：
NA = n (sin µ)
NA的大小跟介質(zhì)的折射率有著直接的關(guān)系，如果各位生命科學(xué)研究者高中數(shù)學(xué)還沒有忘干凈的話，應(yīng)該知道sinzui大值只有1,，所以介質(zhì)折射率越大,，物鏡的NA值越大，這也是為什么我們高倍顯微鏡是油鏡的原因,。

答案也就隨之而來,，很顯然，如果樣本不能接觸,，或是加入其他介質(zhì),，我們就只能選擇空氣作為介質(zhì)，從而限制里物鏡的NA值大小,。那么如果可接觸的話,，是不是所有的樣本都用高折射率的介質(zhì)呢？下面我們再來看看下面要說的概念,。

深層成像：球差的困擾,！

上面這組實(shí)驗(yàn)中，我們對折射率為1.38的樣本進(jìn)行了200um的成像,，分別用了三種不同的介質(zhì),，分別是：水折射率為1.33；硅油折射率為1.40,；油折射率為1.51,。在樣本表面成像時，油介質(zhì)無愧其高NA值的強(qiáng)大特性,，成像亮度是三種物鏡之中zui高的,，但是當(dāng)觀察深度至200um的時候，油介質(zhì)的物鏡基本無法觀察到熒光型號,，而在深層觀察時,，成像質(zhì)量的是折射率為1.4的硅油物鏡。Why,？細(xì)心的同學(xué)們應(yīng)該會發(fā)現(xiàn),，我們所用的樣本介質(zhì)為1.38，而硅油的折射率是zui接近樣本的,，所以在深層成像的時候,，介質(zhì)差所造成的球差就會被減到zui小。這種光學(xué)現(xiàn)象對于學(xué)生物的同學(xué)來說可能較難理解,，但是我們從左邊的示意圖可以看出來,，當(dāng)介質(zhì)相近的時候，光路的焦點(diǎn)匯聚更加容易而不會產(chǎn)生在深層觀察時候光線分散的情況,，從而能獲得較好的深層次的熒光信號,。

由上面這組實(shí)驗(yàn),，我們可以得到很多有用的信息，好學(xué)的同學(xué)就會去查詢自己常用的樣本的折射率了吧,？通常來說細(xì)胞樣本的折射率在1.33~1.35,，活體或者厚組織的折射率在1.36~1.38，因此,，當(dāng)我們的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行深層成像的時候,，對于細(xì)胞樣本我們需要盡量選用水介質(zhì)的物鏡，而當(dāng)進(jìn)行厚組織樣本或者果蠅斑馬魚這樣的活體深層成像時,，使用硅油介質(zhì)的物鏡得到的圖像質(zhì)量會更加出色,。當(dāng)然，如果只是樣本表面成像,，油鏡的成像質(zhì)量是的,。

伴隨著深層成像的迫切需求，空間的共定位分析,，也被各位研究者們廣泛使用,，傳統(tǒng)的2D共定位分析得到的結(jié)果往往是錯誤的不真實(shí)的。但是對于空間共定位來說,，我們不可避免的就又要考慮另一個重要的物鏡參數(shù)色差矯正,。

空間共定位分析：不可不談的色差

色差是什么？色差又是如何產(chǎn)生的,？上面的圖例中展示的就是色差的概念。通俗點(diǎn)來說就是由于不同顏色的光波長不一樣,，所以當(dāng)她們通過光學(xué)部件的速度也不一樣,，因此產(chǎn)生了一個光斑在成像的時候顏色分散開的情況產(chǎn)生，這就是色差,。

對于顯微鏡廠商的物鏡系列,，對于綠色紅色的矯正都相當(dāng)?shù)某錾?，絕大多數(shù)廠家對于近紫外的矯正都不盡如人意,。這一點(diǎn)瑕疵在進(jìn)行空間核定位的時候，就會出現(xiàn)很嚴(yán)重的問題,，在獲得成像結(jié)果之后,，我們很難確定我們的熒光標(biāo)記物與核的關(guān)系是真實(shí)的，還是由于色差造成的,。

對此,，各家廠商都有相對應(yīng)的手段，但是只有OLYMPUS在物鏡上下了功夫,，推出了一款號稱SC（超級色差矯正）的60倍物鏡,，恰巧筆者手上真好有這枚物鏡,，便做了如下測試。

上組實(shí)驗(yàn)圖片用自發(fā)熒光小球作為樣本,，用不同激發(fā)光成像,，之后做了3D重構(gòu)。從圖片中我們可以看出,，即便是OLYMPUS顯微鏡的物鏡近紫外的色差依然有0.5um左右的偏差,，而SC物鏡的兩種顏色基本切合，誤差要小于0.1um,，基本上在核定位上就可以得到比較真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果了,。

雙光子物鏡：顛覆性的物鏡設(shè)計(jì)理念

說了這么多概念性的東西，其實(shí)僅僅只是管中窺豹,，顯微鏡系統(tǒng)要更加復(fù)雜的多,，在zui后的篇幅中，筆者也緊跟時代潮流,，談?wù)劕F(xiàn)在打得火熱的雙光子顯微鏡的物鏡,。

雙光子的成像原理使用過雙光子的同學(xué)們應(yīng)該都很清楚，不同于普通的光學(xué)顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)所采用的線性光學(xué),，雙光子成像原理采用的是非線性光學(xué),，同時光源也不再是傳統(tǒng)的可見光，在物鏡的設(shè)計(jì)上不再是傳統(tǒng)那種“真實(shí)還原樣本”這樣的理念了,。針對雙光子成像OLYMPUSzui早推出了雙光子成像的物鏡,，在之后Nikon也緊跟步伐推出了相應(yīng)的產(chǎn)品。

雙光子物鏡首先zui重要的是NA值盡量的大,，這樣可以有效的提高激發(fā)效率,。同時，由于使用近紅外成像,，物鏡的色差矯正也不再針對可見光而是專門對于近紅外光進(jìn)行矯正,。在保證高NA的同時，雙光子物鏡的放大倍率會較小,，這樣可以有效的提高收集視場,，增加我們收集散射熒光信號的能力，從而提高成像質(zhì)量,。當(dāng)然,，這種雙光子物鏡只能使用在雙子系統(tǒng)上，若是在共聚焦系統(tǒng)中使用,，效果是要大打折扣的,。

本文來源于奧林巴斯中國，北京瑞科中儀專注顯微光學(xué),。