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1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí),，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2. 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl,，37℃，60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測,。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí),，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,。
5. 建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。
注意事項(xiàng)
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4. 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。
5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑
相關(guān)產(chǎn)品
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