(一)脾細(xì)胞
1.材料
(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠,。
(2)1640培養(yǎng)液
(3)2.5%FCS-1640營養(yǎng)液
2.操作方法
(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠,。
(2將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上,，在無菌條件下取脾,。
(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球,。
(4)用鑷子輕輕擠壓脾,，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中,。
(5)直立小試管3min,，使大塊的結(jié)締組織下沉,，把細(xì)胞懸液移入離心管中。
(6)以2.5%FCS—1640充滿離心管,，并以400g離心7min～10min(與此同時應(yīng)開始制備骨髓細(xì)胞),。
(7)把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。
(8)重復(fù)⑹,、⑺步驟,。
(9)計算細(xì)胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80%為合格,。
(二)骨髓瘤細(xì)胞
骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后,，可能影響或降低所分泌抗體的滴度,，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。
選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系,，以便兩者的組織相容性抗原一致;②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài),，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外;③骨髓瘤細(xì)胞生長需要一個較高的細(xì)胞密度,106個細(xì)胞/ml;④生長速度快，繁殖時間短,。
目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(簡稱SP2);③P2—X? ­—Ag8·6·5·3(簡稱653);④FO
以653zui為常用,，它是由礦物油4-甲基-15烷(Pristane，降植烷)誘發(fā)出來的一種漿細(xì)胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,，MOPC)并經(jīng)過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系,。
骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中,，試驗時復(fù)蘇,、增殖、傳代即可,。
由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài),，很容易脫落，因此不需要胰酶處理,。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8-氮鳥嘌呤,。取約1×107～6×107對數(shù)生長期(即培養(yǎng)15h～20h)的骨髓瘤細(xì)胞,，在室溫離心(400g)10min，沉淀以2.5%FCS—1640液再懸浮并計數(shù),。
(三)飼養(yǎng)細(xì)胞
在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中,，單個的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長繁殖,，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder cell),。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過程中,，就是在少量的或單個細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞,。許多種類的動物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞,，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞,、腹腔滲出細(xì)胞等,，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞,，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長造成良好的環(huán)境,。腹腔細(xì)胞的來源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠,。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠,，昆明小白鼠等,。
1.材料
(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。
(2)11.6%蔗糖溶液(經(jīng)10磅30min高壓滅菌),。
2.操作方法
(1)拉頸處死小鼠,。
(2)70%酒精浸泡消毒10min。
(3)用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一小口,，剝開皮膚,，露出腹腔。
(4)用注射器將4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體,，加入離心管。
(5)1 000r/min離心10min,。
(6)取上清,，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞,，使每毫升含40萬個活細(xì)胞,。
(7)以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml,，含2萬個細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用,。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時再加入一些,。