ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）的簡(jiǎn)稱,。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái),，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域,。

　　（一）　原理

　　ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原,、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,，每加入一種試劑孵育后,，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性,。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì),，具體的方法步驟可有多種,。即:用于檢測(cè)抗體的間接法（圖a）,、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法,。

　　（二）　操作步驟

　　方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml,。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜,。次日，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘,。（簡(jiǎn)稱洗滌,，下同）。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃孵育1小時(shí),。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔,，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）,。

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌,。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘,。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽(yáng)性程度越強(qiáng),，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”、“-”號(hào)表示,。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上,，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處,，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,，即為陽(yáng)性,。

　　方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,，

　　　　　　每孔加0.1ml,，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次,。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔

　　　　　　中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白,、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml,，

　　　　　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌,。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5,、6,。

　　（三）　試劑器材

　　1.　試劑

　　（1）　包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:

　　　　　　NaCO３1.59克

　　　　　　NaHCO３　2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　（2）　洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M

　　　　　　KH2PO4　　　　　0.2克

　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　（3）　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白（BSA）0.1克

　　　　　　　加洗滌緩沖液至100ml

　　　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用,。

　　（4）　終止液（2M　H２SO４）：

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。

　　（5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

　　　　0.2MNa２HPO４（28.4克／L）25.7ml

　　　　0.1M檸檬酸（19.2克／L）　　　　　24.3ml

　　　　加蒸餾水50ml,。

　　（6）　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:

　　　　TMB（10mg／5ml無(wú)水乙醇）0.5ml

　　　　底物緩沖液（PH5.5）　　　10ml

　　　　0.75％H２O２　　　32μl

　　（7）　ABTS使用液:

　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　　　　底物緩沖液（PH5.5）　1ml

　　　　3％H２O２　　2μl

　　（8）　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體,。

　　（9）　正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。

　　2.　器材:

　　（1）　聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板）40孔或96孔,，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器,，塑料滴頭,，小毛巾，洗滌瓶,。

　　（2）　小燒杯、玻璃棒,、試管,、吸管和量筒等。

　　（3）　4℃冰箱,，37℃孵育箱,。

　　（四）　注意事項(xiàng)

　　1.　正式試驗(yàn)時(shí),，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份,，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,，說(shuō)明有非特異性反應(yīng),，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉,。

　　2.　在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,，其中包括:

　　（1）　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯、聚苯乙烯,、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板,、試管,、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板,。不管何種載體,，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。

　?。?/span>2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí),。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1,、1.0和10μg／ml等）進(jìn)行包被后,，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值,。選擇OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度,。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg／ml。

　　（3）　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份）,。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度,。

　　（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉,、安全、有明顯地顯色反應(yīng),，而本身無(wú)色,。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護(hù),。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時(shí)間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。