可溶性白細(xì)胞介素2受體SIL-2R存在于人的血清,、尿液及腦脊液中，其濃度的高低與許多疾病的發(fā)生,、發(fā)展,、治療效果及預(yù)后有密切，如成人T淋巴細(xì)胞白血?。ˋTL）艾滋病,、B細(xì)胞慢淋、毛細(xì)胞白血病,，以及腎移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)或異基因骨髓移植發(fā)生移植物抗宿主時(shí),，患者血清中SIL-2R水平明顯升高。SIL-2R的檢測(cè)多采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù),，其中夾心法ELISA是一種較簡單的檢測(cè)方法,，國外已廣泛應(yīng)用于臨床及基礎(chǔ)免疫學(xué)研究。

㈠ 基本原理：

將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體,，識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清等標(biāo)本中Tac并與之結(jié)合,。應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識(shí)別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合。通過酶催化底物顯色反映待檢標(biāo)本中游離Tac的水平,。

㈡ 操作步驟：

1. 刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：取外周血10ml,，肝素抗凝，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞,，加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,，2×106/孔，RPMI1640-10%FCS+PHA（3μg/ml,，37℃,、5%CO2培養(yǎng)72小時(shí),收集上清，-20℃保存待測(cè),。同時(shí)設(shè)未加PHA對(duì)照組,。犚2可選用病人血清為待測(cè)標(biāo)本。

2. Ab1包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體（Ab1）犗!釋至5μg/ml,，加至elisa板,，100μl/孔，4℃包被72小時(shí),。

3. 封閉：1%BSA-PBS封閉,，350μl/孔，37℃孵育2小時(shí),。

4. 加樣：ELISA板用PBS-T洗液洗3次,，牻+PHA刺激單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024，每一稀釋度取100μl加至ELISA板,。犙!HUT-102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清為陽性對(duì)照,，RPMI1640-10%FCS培養(yǎng)液為陰性對(duì)照,。37℃，孵育2小時(shí),，洗滌,。

5. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記另一種抗 Tac 特異性單克隆抗體Ab2以效價(jià)滴定的*稀釋度稀釋）100μl。37℃孵育2小時(shí),，洗滌,。

6. 加底物顯色：各反應(yīng)孔加新鮮配制ABTS底物溶液100μl，37℃,、孵育15分鐘,。

7. 終止反應(yīng)：各反應(yīng)孔加2%氟化鈉終止液50μl。

8. 結(jié)果判定：首先肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色,，稀釋梯度是否均勻,。陽性、犚u性結(jié)果是否明顯,。然后于ELISA檢測(cè)儀上測(cè)各孔O.D值（410nm）,。

㈢ 試劑器材：

1. 試劑：包被緩沖液、洗滌液,、稀釋液、終止液配制同常規(guī)ELISA方法,。Tac特異性單克隆抗體,、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Tac特異性單克隆抗體,HUT-102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清,PHA。

2. 器材：聚苯乙烯塑料板,，ELISA檢測(cè)儀,，37℃水浴箱，4℃冰箱,，CO2孵箱,。可調(diào)加樣器,。

㈣ 注意事項(xiàng)：

1. 包被抗體活性要較高,，否則影響本實(shí)驗(yàn)敏感性。

2. 經(jīng)篩選比較,，封閉液以1%BSA-PBS為好,。

3. 酶標(biāo)結(jié)合物應(yīng)用前應(yīng)進(jìn)行效價(jià)滴定，選擇*工作濃度,。

4. 底物應(yīng)選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等,。

5. 如有條件，酶標(biāo)McAb可由生物素-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替,，以增加實(shí)驗(yàn)的敏感性,。