酶標(biāo)儀中的熒光檢測(cè)技術(shù)

1.概述
室溫下,，大多數(shù)分子處于基態(tài)的zui低振動(dòng)能級(jí),，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能,、化學(xué)能,、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài),，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定,，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量,，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象”,。分子發(fā)光包括熒光，磷光,，化學(xué)發(fā)光,，生物發(fā)光等。受到光照時(shí)發(fā)光,，光照切斷時(shí)發(fā)光立即消失的叫熒光,，光照切斷時(shí)，發(fā)光逐漸變?nèi)跻灾孪У慕辛坠?，吸收化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)能量而發(fā)光叫化學(xué)發(fā)光,，由生物能轉(zhuǎn)變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。

由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分,，分子熒光為帶光譜,，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光,。通過測(cè)定所發(fā)射熒光的特性和強(qiáng)度,，可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性,、定量分析,。

2.熒光檢測(cè)技術(shù)
2.1熒光強(qiáng)度（FI）
熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比,，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛,，可以進(jìn)行生物大分子定量,，酶活性分析，熒光免疫分析,，細(xì)胞學(xué)分析（細(xì)胞增殖,，細(xì)胞毒理，細(xì)胞吸附等）和分子間相互作用,。

2.1.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能,。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中,，在凋亡的早期階段，它被激活,，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小 亞基（12KD）組成,，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，zui終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞,，caspase-3的活性明顯下降。
設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC,。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí),，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC,，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光（圖1）,。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定 caspase-3的活性,，從而反映Caspase-3被活化的程度,。

2.1.2細(xì)胞毒性的檢測(cè)
體外細(xì)胞毒性研究對(duì)于檢測(cè)新的生物來(lái)源或人工合成的細(xì)胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測(cè)都有著重要的意義。細(xì)胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細(xì)胞膜,，熒光密度越高反映出其受損細(xì)胞越多,。

2.1.3鈣流檢測(cè)
Fura-2、indo-1,、Quin-2是Ca2+熒光指示劑,，可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當(dāng)結(jié)合鈣離子時(shí),，zui大激發(fā)波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生改變,，發(fā)射熒光的強(qiáng)度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系,。

2.2熒光偏振（FP）
1926年P(guān)errin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時(shí),，可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光,，如果在激發(fā)時(shí)熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性,，如果其處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài),，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象,，熒光分子與其它因子的相互作用,，例如相互結(jié)合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì),，例如溶液的粘度,、溫度等，這些因素都有可能對(duì)這個(gè)熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響,。因此以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來(lái)研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用,，如受體配體結(jié)合分析，DNA－蛋白質(zhì)結(jié)合分析,，SNP分析,，酶活性分析。

熒光偏振分析所需的樣品量少,，靈敏度高,，可達(dá)亞納摩爾級(jí)范圍，重復(fù)性好,，操作簡(jiǎn)便,，也更為安全可靠，不會(huì)在實(shí)驗(yàn)過程中生成有害的放射性廢物,，此外熒光偏振是真正均相的,，允許實(shí)時(shí)檢測(cè)（動(dòng)力學(xué)檢測(cè)），對(duì)于濃度變化不敏感,，是均相檢測(cè)形式（中間不含洗滌步驟）的*解決方案,。

目前市場(chǎng)上多款酶標(biāo)儀都可以用來(lái)做熒光偏振檢測(cè)，Invitrogene公司專門利用Predictor™ hERG對(duì)多款酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光偏振測(cè)試分析（表1）,。

2.3時(shí)間分辨熒光（TRF）
在做熒光測(cè)定的時(shí)候,，由于背景熒光信號(hào)干擾，使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的靈敏度就會(huì)嚴(yán)重下降,。大部分背景熒光信號(hào)是短時(shí)存在的,，因此使用長(zhǎng)衰減壽命的標(biāo)記物就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到zui小化。
時(shí)間分辨熒光是用稀土元素作為標(biāo)記物,，稀土三價(jià)離子的電子云的結(jié)構(gòu)會(huì)一定程度上限制了電子的遷移,，導(dǎo)致這類元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長(zhǎng)的,，從而消除背景熒光的干擾 大大提高檢測(cè)的靈敏度（表2）。應(yīng)用稀土元素作標(biāo)記物的另一個(gè)好處是激發(fā)光與發(fā)射光峰值Stoke 位移大,。這就可消除激發(fā)光和散射光的干擾,，同時(shí), 被激發(fā)的熒光光帶極窄, 熒光的發(fā)射峰非常尖銳, 可使儀器調(diào)整在極窄的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定, 極大地降低了來(lái)自背景的各種干擾。
熒光團(tuán) 熒光壽命（ns）
非特異熒光背景 1～10
人血清白蛋白 4.1
球蛋白 3.0
細(xì)胞色素C 3.5
異硫氰酸熒光素（FITC） 4.5
丹磺酰氯 14
稀土螯合物 103～106

2.4熒光共振能量傳遞（FRET）
熒光共振能量傳遞現(xiàn)象是Perrin在20世紀(jì)初首先發(fā)現(xiàn)的,，1948年,，F(xiàn)oster創(chuàng)立了理論原理,，指熒光能量供體與受體間通過偶極－偶極耦合作用轉(zhuǎn)移能量的過程,，這種能量的轉(zhuǎn)移是非放射性的，產(chǎn)生FRET的條件主要有三個(gè)：（1）供體與受體間足夠靠近（1～10 nm）,；（2）供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有一定的重疊,；（3）給體與受體的偶一定的空間取向，這是偶極－偶極耦合作用的條件,。
熒光共振能量傳遞因?yàn)橐紤]到供體和受體之間的距離,，所以經(jīng)常用來(lái)研究分子間的相互作用，像蛋白質(zhì)的相互作用,，抗原抗體結(jié)合,，受體與配體的結(jié)合，另外在膜反應(yīng),、離子通道等方面的研究也有相應(yīng)應(yīng)用,。將FRET熒光探針標(biāo)記的肽鏈，加入到固體表面的雙層膜中,，通過熒光漂白恢復(fù)（FRAP）成像技術(shù)檢測(cè),，為研究跨膜螺旋二聚作用提供一個(gè)新的方法。用FRET標(biāo)記細(xì)胞質(zhì),，應(yīng)用時(shí)間分辨技術(shù),，檢測(cè)其對(duì)P2X離子通道的門控作用。

利用Eu等長(zhǎng)效熒光物質(zhì)作為供體,，來(lái)進(jìn)行熒光共振能量傳遞,，在激發(fā)光熄滅后受體仍能較長(zhǎng)的能量衰減時(shí)間，能量傳遞效率更高,，可檢測(cè)的相互作用距離更長(zhǎng),，可達(dá)到100-200nm，時(shí)間延遲檢測(cè),，降低了背景噪音,，提高了靈敏度