細(xì)胞處于活躍的增值狀態(tài)或者通過人工的各種處理后,,細(xì)胞進(jìn)入分裂的動(dòng)物組織科用于染色體的分析。由于在正常的動(dòng)物骨髓內(nèi),細(xì)胞是處于不斷分裂的,,給其注射一定的秋水仙堿可以讓許多細(xì)胞處于分裂的細(xì)胞停在細(xì)胞分裂中期,,然后采用常規(guī)空氣干燥法制備染色體,,即可得到大量可分析的染色體標(biāo)本,。
實(shí)驗(yàn)用品
一、 材料
小白鼠
器材
水平離心機(jī),、顯微鏡,、刻度離心管(10ml)、注射器(1ml),、載玻片,、燒杯(400ml)、量筒(100ml),、試管架,、鑷子、剪刀,、解剖刀,、吸管。
二、 試劑
1. 2%檸檬酸鈉溶液:稱取2g檸檬酸鈉(檸檬酸三鈉,,Tri-sodium citrate, AR)溶解于100ml蒸餾水中,。
2. 1%檸檬酸鈉溶液。
3. 500μm/ml,、100mg/ml秋水仙素溶液,。
4. Giemsa(姬姆薩)原液(pH6.8)
Giemsa染粉 1g
甘油(丙三醇,glycerine, AR) 33ml
甲醇(methyl alcoholA, AR) 45ml
將染粉傾入乳缽,,加幾滴甘油,,在乳缽內(nèi)研磨直到無顆粒為止,此時(shí)再將全部剩余甘油倒入,,放入60~65℃保溫箱中保溫2h后,加入甲醇攪拌均勻,,保存于棕色瓶中備用,。
5. 0.067mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)
Na2HPO4·12H2O11.81g
(或Na2HPO4·2H2O 5.92g)
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?、?小白鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法
實(shí)驗(yàn)方法
1.動(dòng)物按4μg/g體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素,,3~4h后殺死動(dòng)物。
2.取出動(dòng)物后肢的脛骨和股骨,。剪去兩端,。
3.將0.6~1ml 2%檸檬酸鈉用1ml注射器接上5#針頭注入骨髓腔,將骨髓細(xì)胞先沖入小碟取下注射器針頭,,反復(fù)吸打骨髓細(xì)胞,,使細(xì)胞團(tuán)塊分散,轉(zhuǎn)入10ml離心管,。
4.視骨髓量之多寡加入0.4%KCl溶液8~10ml,,隨即將離心管置37±0.5℃水浴中低滲15~20min
5.以1000r/min離心8min
6.棄上清液,沿離心管壁緩慢加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液5ml,,加固定液時(shí)注意不要沖動(dòng)細(xì)胞團(tuán)塊,。
7.加完固定液后,立即用吸管將細(xì)胞輕輕吸打均勻,,靜置固定20min,。如此反復(fù)固定2~3次,每次20min,。
8.固定的細(xì)胞經(jīng)離心后,,吸取上層固定液,視管底的細(xì)胞多寡加入少量新配制的固定液,,將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕吸打成懸液,。
9.在干凈、濕,、冷的載玻片上滴2~3滴上層細(xì)胞懸液,,在酒精燈上文火烘干(在空氣干燥的地方可不用),。
10.將玻片標(biāo)本平放于支架上,細(xì)胞面朝上,,每片滴加1:100 Giemsa磷酸鹽緩沖液3~4ml,,染色10min。
11.在自來水管下細(xì)流沖洗數(shù)秒,,去掉Giemsa磷酸鹽緩沖液,,用小塊紗布擦干玻片標(biāo)本底面和四周,顯微鏡觀察和分析,。
通過以上步驟就制備出可以進(jìn)行觀察的小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本,,用相應(yīng)的顯微鏡及可進(jìn)行觀察實(shí)驗(yàn)。
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