葉綠素含量的測定

一,、原理
根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收,，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度,，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律,，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比,，即A＝αCL式中：α比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位,，液層厚度為1cm時,，α為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得,。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì),，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性,。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a,、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A,，并根據(jù)葉綠素a,、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a,、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾,，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的zui大吸收峰。

二,、材料,、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：新鮮（或烘干）的植物葉片,。
（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計,；2. 電子頂載天平（感量0.01g）；3. 研缽,；4. 棕色容量瓶,；5. 小漏斗；6. 定量濾紙,；7. 吸水紙,；8. 擦境紙；9. 滴管。
（三）試劑：96％乙醇（或80％丙酮）,；石英砂,；碳酸鈣粉。

三,、實驗步驟
1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料,，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈）,，混勻,。2. 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份,，分別放入研缽中,，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml95％乙醇，研成均漿,，再加乙醇10ml,，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min,。3. 取濾紙1張,，置漏斗中，用乙醇濕潤,，沿玻棒把提取液倒入漏斗中,，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽,、研棒及殘渣數(shù)次,，zui后連同殘渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇,，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中,。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。zui后用乙醇定容至25ml,，搖勻,。5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95％乙醇為空白,，在波長665nm,、649nm下測定吸光度。

四,、實驗結(jié)果計算：將測定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.9₆₆₅－6.88A₆₄₉,；Cb=24.96A₆₄₉－7.32A₆₆₅。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca,、Cb：mg/L）,，二者之和為總?cè)~綠素的濃度,。zui后根據(jù)下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：
葉綠素的含量（mg/g）= [葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重（或干重）。