MC3T3細(xì)胞相關(guān)操作：

培養(yǎng)條件：

每兩天換液一次

無菌恒溫培養(yǎng)箱

37℃

5% CO2

PH值7.2~7.4

*培養(yǎng)基成分: 不含酚紅 α-MEM,、10% FBS, 0.1 mg/mL L-谷氨酸鹽, and 1% 雙抗（100 U ml−1 青霉素 and 100 μg ml−1 鏈霉素）,（ 20 mM HEPES?）

誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化：上述+50 μg/mL 抗壞血酸and 10 （5？）mM β-磷酸甘油

細(xì)胞復(fù)蘇

1.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（αMEM+10% FBS）,；

2.從液氮中取出細(xì)胞迅速放入37°C水浴快速解凍（解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞）；

3.在超凈臺中加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，1000rpm離心5min,；

4.棄上清，加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中,，輕輕晃勻,；

5.置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)瓶蓋沒有透氣孔的話,，瓶蓋不要擰太緊）,；

6.第二天，用新鮮的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液后繼續(xù)培養(yǎng),。

細(xì)胞傳代

1.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時,，給細(xì)胞傳代；

2.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（αMEM+10% FBS）,；

3.在超凈臺中,，棄培養(yǎng)基，加入2-5mlPBS清洗細(xì)胞后,，再加入1ml胰酶消化細(xì)胞,；

4.顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓，有細(xì)胞開始脫離瓶壁時,，加入5ml培養(yǎng)基（αMEM+10% FBS）終止消化,；

5.用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞，并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹散,；

6.將細(xì)胞移入離心管中,，1000rpm離心5min；

7.棄上清,，加入15-20ml的培養(yǎng)基（含血清）重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中或按適當(dāng)比例傳到T25瓶中（確保細(xì)胞貼壁后融合度在25-50%之間）,，細(xì)胞密度在1×104 cells/cm2 （2.5×105 cells/T-25瓶），混勻細(xì)胞懸液,，確保細(xì)胞均勻分布,；

8.將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法：

培養(yǎng)基：D-MEM（低糖）（450 mL）,、10%FBS（50ml）,、10mg/mL慶大霉素（250ul）、0.1 mg/mL L-谷氨酸鹽

無菌恒溫培養(yǎng)箱

37℃

5% CO2

1,、接種細(xì)胞后,，每48h更換一次培養(yǎng)基。每周傳代兩次,，傳代時機選在分裂率為1：3或1：4時進(jìn)行,。通常試驗選用3-8傳代細(xì)胞。

2,、細(xì)胞鑒定：

①第四傳代,，去除培養(yǎng)基，加入3 ml of 0.25% （重量/體積） 胰蛋白酶/0.02% （重量/體積） EDTA,，室溫下消化3min,。沖洗細(xì)胞，加入1 ml冷PBS（4—8℃）,，4℃下300g離心8min,，離心兩次。每個離心管中用100ul冷PBS懸浮1×106個細(xì)胞,，使用抗鼠FITC標(biāo)記Sca-1, CD11b and CD45抗體染色,，或者是PE標(biāo)記  CD29, CD31, CD34, CD44, CD86, CD105, Ia抗體染色，留一管用作對照,。

②細(xì)胞在暗環(huán)境下于4℃環(huán)境中染色30min

③沖洗細(xì)胞,，加入1 ml冷PBS（4—8℃），4℃下300g離心8min,，離心兩次,。

④為了評估細(xì)胞生活狀況，在300ul冷PBS中加入PI（0.6 µg 每百萬細(xì)胞）,，加入細(xì)胞中,，室溫暗環(huán)境下孵育15min。

⑤采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞,。使用FL1,、FL2發(fā)射通道。每個樣本收集201,000個事件,。

3,、成骨細(xì)胞分化：

①第四傳代，去除培養(yǎng)基,，加入3 ml of 0.25% （重量/體積） 胰蛋白酶/0.02% （重量/體積） EDTA,，室溫下消化3min。

②24孔每孔接種1 × 104 個細(xì)胞。培養(yǎng)基為α-MEM,，10% （體積分?jǐn)?shù)） FBS, 10 − 7 M 地塞米松, 10 mM β-甘油磷酸鈉 and 50 µM 2-磷酸抗壞血酸鹽,，每孔培養(yǎng)基500ul。

③每周更換兩次培養(yǎng)基,，培養(yǎng)2-4周,，該期間細(xì)胞不傳代

④14天后,，使用Alkaline Phosphatase Kit在6孔板上測定ALP活性,。

⑤再培養(yǎng)14d。

⑥von Kossa染色評估礦化情況,，每孔將培養(yǎng)基替換為多聚甲醛,，處理30min

⑦每孔用3ml蒸餾水沖洗3min，共沖洗3遍

⑧每孔以300 µl,，5%（wt/vol）硝酸銀溶液染色,，在光下孵育30min

⑨每孔用3ml蒸餾水沖洗3min，共沖洗3遍

10吸凈水,，每孔加入300 µl,，5% （wt/vol）硫代硫酸鈉溶液，處理5min

11每孔用3ml蒸餾水沖洗3min,，共沖洗3

                           艾澤信：www.ai-zx.com