本研究以農(nóng)藥三唑磷及克百威為研究對(duì)象,，采用分子模擬方法對(duì)其半抗原分子進(jìn)行了設(shè)計(jì)并合成得到了兩種優(yōu)化的三唑磷半抗原兩種半抗原O-乙基,，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,，N-（3-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THBu）,、O-乙基,，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（5-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THHe）和一種克百威半抗原4—[[（2,，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]丁酸（BFNB）,。上述半抗原分別與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原,，免疫小白鼠，再采用雜交瘤技術(shù)制備出了對(duì)應(yīng)單克隆抗體,。經(jīng)測(cè)定,，抗體（腹水）的效價(jià)均在10~6以上，與對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率均較低,，表現(xiàn)出很高的特異性,。 在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)固相載體,、包被緩沖液,、有機(jī)溶劑、包被條件,、洗滌次數(shù),、酶的種類(lèi)、封閉物種類(lèi),、點(diǎn)板時(shí)間,、工作濃度、穩(wěn)定劑以及不同ELISA模式等因素的篩選比較,，優(yōu)化了三唑磷和克百威ELISA方法和條件,。優(yōu)化后結(jié)果顯示：Costar酶標(biāo)板（美國(guó)）吸附效果和均一性較好；抗體以PBS（pH 7.4,，0.01M）作為包被介質(zhì)較為理想,，人工抗原則以CBS（pH 9.5，0.05M）作為包被介質(zhì)較為理想,；包被條件以在37℃下包被2h效果為佳,；反應(yīng)介質(zhì)加入2％牛奶可減少非特異性吸附，提高檢測(cè)靈敏度,；有機(jī)溶劑中甲醇對(duì)ELISA反應(yīng)的影響較小,，反應(yīng)體系中zui終含量10％為佳,；HRP酶作為顯色反應(yīng)的催化劑比AP酶更為理想；包被抗原直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA模式OD值的平行性不如包被抗體直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA模式的好,；優(yōu)化出的穩(wěn)定劑可使包被在酶標(biāo)板上的抗體在37±1℃條件下保存14天而抗體活性基本保持不變。 利用優(yōu)化后的分析條件,，建立了農(nóng)藥三唑磷異源直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法（包被抗體模式）和克百威直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法（包被二抗模式）,。在考察了不同樣品基質(zhì)對(duì)ELISA方法的影響后，進(jìn)一步對(duì)蔬菜樣品,、水果樣品,、水、土等環(huán)境樣品進(jìn)行了三唑磷和克百威添加回收率試驗(yàn),，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,，考察了方法的準(zhǔn)確度與精密度，并對(duì)不同處理組間,、相同處理組板間的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn),，確定了不同樣品的方法本底值、zui低檢測(cè)限及檢測(cè)結(jié)果陰性／陽(yáng)性判定方法,，zui終構(gòu)建了三唑磷ELISA快速測(cè)定試劑盒和克百威ELISA快速測(cè)定試劑盒,。結(jié)果表明，三唑磷ELISA方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了2.66 ng／mL（檢測(cè)線性范圍為1.95-2000ng／mL）,，克百威ELISA方法的檢測(cè)靈敏度為0.97 ng／mL（檢測(cè)線性范圍為0.8-340 ng／mL）,，實(shí)際樣品中的zui低檢測(cè)限達(dá)到或接近（部分超過(guò)）了一些國(guó)家和地區(qū)的殘留*（MRL）標(biāo)準(zhǔn)。 通過(guò)本課題的研究,，在國(guó)內(nèi)外研制出了三唑磷半抗原,、抗三唑磷單克隆抗體及其ELISA試劑盒；在國(guó)內(nèi)研制出了抗克百威單克隆抗體及其ELISA試劑盒,；在國(guó)內(nèi)系統(tǒng)建立了農(nóng)藥等小分子化合物ELISA快速測(cè)定試劑盒國(guó)產(chǎn)化生物試劑的技術(shù)體系,。試制的試劑盒產(chǎn)品經(jīng)農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所、農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津）,、等5家檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)用,，證明該技術(shù)可靠，產(chǎn)品質(zhì)量和性能穩(wěn)定,，可用于指導(dǎo)生物試劑,。（轉(zhuǎn)自 論文網(wǎng)）