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欣美生物雙向電泳操作步驟介紹

來源：上海欣美生物科技有限公司 2013年09月05日 07:14

水化上樣（被動上樣）

1. 從冰箱中取出 IPG 膠條，室溫放置 10min,。

2. 沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品,，槽兩端各 1cm 左右不加樣,，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡,，否則會影響膠條中蛋白質(zhì)的分布,。

3. 用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護層。注意：堿性端較脆弱,，應(yīng)小心操作,。

4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面,，因為這些溶液不會被膠條吸收; 還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡,。如產(chǎn) 生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端,，上下移動膠條,，直到氣泡被趕走。

5. 放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收,，沿著膠條緩慢加入礦物油，每根膠條約 3ml（17cmIPG）,，防止膠條水化過程中液體蒸發(fā),。

6. 置等電聚焦儀于- 20℃水化 11~15h。

*向等電聚焦

1. 將紙電極置于聚焦盤的正負極上,，加 ddH2O 5~8μl 潤濕,。

2. 取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干,，膠面朝下,，將其置于剛好潤濕的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

3. 將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中,，膠條的正極（標有+）對應(yīng)于聚焦盤的正極,，確保膠條與電極緊密接觸。

4. 在每根膠條上覆蓋 2- 3ml 礦物油,。

5. 對好正,、負極，蓋上蓋子,。設(shè)置等電聚焦程序,。

6. 聚焦結(jié)束的膠條，立即進行平衡,、第二向 SDS-Page電泳,。或?qū)⒛z條置于樣品水化盤中,，- 20℃冰箱保存,，電泳前取出膠條,，室溫放置10 分鐘，使其溶解,。

第二向 SDS-PAGE電泳

1. 配制 12%的丙烯酰胺凝膠,。

2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水,、乙醇或水飽和正丁醇,，用MilliQ 水沖洗。

3. 配制膠條平衡緩沖液 I

4. 在桌上先放置干的厚濾紙,，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上,。將另一份厚濾紙用 MilliQ水浸濕，擠去多余水分,，然后直接置于膠條上,，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋,。

5. 將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中,，加入 6ml（17cmIPG）平衡緩沖液 I ，在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘,。

6. 配制膠條平衡緩沖液 II ,。

7. *次平衡結(jié)束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體,，放入平衡緩沖液 II 中,，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。

8. 用濾紙吸去 sds-page膠上方玻璃板間多余的液體,，將二向凝膠放在桌面上,，凝膠的頂部面對自己。

9. 將瓊脂糖封膠液加熱溶解,。

10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液,。

11. 第二次平衡結(jié)束后，取出膠條,，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上,，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面*浸末在 1×電泳緩沖液中漂洗數(shù)次,。

13. 將膠條背面朝向玻璃板,，輕輕放在長玻板上，加入低熔點瓊脂糖封膠液,。

14. 用適當(dāng)厚度的膠片,，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面*接觸,。注意：不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡,，應(yīng)推動凝膠背面的支撐膜,，不要碰到面膠。

15. 放置 5 分鐘,，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固,。

16. 打開二向電泳制冷儀，調(diào)溫度為 15℃,。

17. 將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中,，加入電泳緩沖液，接通電源,，起始時用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm） ,，待樣品在*走出IPG 膠條，濃縮成一條線后,，再加大電流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳,。

18. 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃,，取出凝膠,，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面） ,。

19. 進行染色,。

相關(guān)產(chǎn)品

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