親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短,，通常10cm左右,。上樣時應(yīng)注意選擇適當?shù)臈l件，包括上樣流速,、緩沖液種類,、pH、離子強度,、溫度等,，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。

 

一般生物大分子和配體之間達到平衡的速度很慢,，所以樣品液的濃度不易過高,，上樣時流速應(yīng)比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時間進行吸附,。特別是當配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高,、雜質(zhì)較多時，可以在上樣后停止流動,，讓樣品在層析柱中反應(yīng)一段時間,，或者將上樣后流出液進行二次上樣，以增加吸附量,。樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強的親和力,。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強度，以減小基質(zhì),、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附,。

 

生物分子間的親和力是受溫度影響的,，通常親和力隨溫度的升高而下降,。所以在上樣時可以選擇適當較低的溫度，使待分離的物質(zhì)與配體有較大的親和力,，能夠充分的結(jié)合;而在后面的洗脫過程可以選擇適當較高的溫度,，使待分離的物質(zhì)與配體的親和力下降，以便于將待分離的物質(zhì)從配體上洗脫下來,。

 

上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質(zhì),。平衡緩沖液的流速可以快一些，但如果待分離物質(zhì)與配體結(jié)合較弱,，平衡緩沖液的流速還是較慢為宜,。如果存在較強的非特異性吸附,，可以用適當較高離子強度的平衡緩沖液進行洗滌，但應(yīng)注意平衡緩沖液不應(yīng)對待分離物質(zhì)與配體的結(jié)合有明顯影響,，以免將待分離物質(zhì)同時洗下,。

 

2.洗脫

 

親和層析的另一個重要的步驟就是要選擇合適的條件使待分離物質(zhì)與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫,。

 

（1）特異性洗脫

 

特異性洗脫是指利用洗脫液中的物質(zhì)與待分離物質(zhì)或與配體的親和特性而將待分離物質(zhì)從親和吸附劑上洗脫下來,。

 

特異性洗脫也可以分為兩種：一種是選擇與配體有親和力的物質(zhì)進行洗脫，另一種是選擇與待分離物質(zhì)有親和力的物質(zhì)進行洗脫,。前者在洗脫時,，選擇一種和配體親和力較強的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)競爭對配體的結(jié)合,，在適當?shù)臈l件下,，如這種物質(zhì)與配體的親和力強或濃度較大，配體就會基本被這種物質(zhì)占據(jù),，原來與配體結(jié)合的待分離物質(zhì)被取代而脫離配體,，從而被洗脫下來。例如用凝集素作為配體分離糖蛋白時,，可以用適當?shù)膯翁窍疵?，單糖與糖蛋白競爭對凝集素的結(jié)合，可以將糖蛋白從凝集素上置換下來,。后一種方法洗脫時,，選擇一種與待分離物質(zhì)有較強親和力的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與配體競爭對待分離物質(zhì)的結(jié)合,，在在適當?shù)臈l件下,，如這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)的親和力強或濃度較大，待分離物質(zhì)就會基本被這種物質(zhì)結(jié)合而脫離配體,，從而被洗脫下來,。例如用染料作為配體分離脫氫酶時，可以選擇NAD+進行洗脫,，NAD+是脫氫酶的輔酶,，它與脫氫酶的親和力要強于染料，所以脫氫酶就會與NAD+結(jié)合而從配體上脫離,。特異性洗脫方法的優(yōu)點是特異性強,，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率,。另外對于待分離物質(zhì)與配體親和力很強的情況,，使用非特異性洗脫方法需要較強烈的洗脫條件，很可能使蛋白質(zhì)等生物大分子變性,，有時甚至只能使待分離的生物大分子變性才能夠洗脫下來,，使用特異性洗脫則可以避免這種情況,。由于親和吸附達到平衡比較慢，所以特異性洗脫往往需要較常的時間和較大的洗脫條件,，可以通過適當?shù)母淖兤渌鼦l件,，如選擇親和力強的物質(zhì)洗脫、加大洗脫液濃度等等,，來縮小洗脫時間和洗脫體積,。

 

（2）非特異性洗脫

 

非特異性洗脫是指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強度,、溫度等條件,，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來。

 

當待分離物質(zhì)與配體親和力較小時,，一般通過連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗,，就可以在雜質(zhì)之后將待分離物質(zhì)洗脫下來，這種洗脫方式簡單,、條件溫和,，不會影響待分離物質(zhì)的活性。但洗脫體積一般比較大,，得到的待分離物質(zhì)濃度較低,。當待分離物質(zhì)和配體結(jié)合較強時，可以通過選擇適當?shù)膒H,、離子強度等條件降低待分離物質(zhì)與配體的親和力,，具體的條件需要在實驗中摸索?？梢赃x擇梯度洗脫方式,，這樣可能將親和力不同的物質(zhì)分開。如果希望得到較高濃度的待分離物質(zhì),，可以選擇酸性或堿性洗脫液,，或較高的離子強度一次快速洗脫，這樣在較小的洗脫體積內(nèi)就能將待分離物質(zhì)洗脫出來,。但選擇洗脫液的pH,、離子強度時應(yīng)注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性，而且洗脫后應(yīng)注意中和酸堿,，透析去除離子,，以免待分離物質(zhì)喪失活性,。對于待分離物質(zhì)與配體結(jié)合非常牢固時,，可以使用較強的酸、堿或在洗脫液中加入脲,、胍等變性劑使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性,，而從配體上解離出來,。然后再通過適當?shù)姆椒ㄊ勾蛛x物質(zhì)恢復(fù)活性。