親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法,。親和層析柱一般很短,，通常10cm左右。上樣時(shí)應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件,，包括上樣流速,、緩沖液種類、pH,、離子強(qiáng)度,、溫度等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上,。

 

一般生物大分子和配體之間達(dá)到平衡的速度很慢,，所以樣品液的濃度不易過高,，上樣時(shí)流速應(yīng)比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時(shí)間進(jìn)行吸附,。特別是當(dāng)配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高,、雜質(zhì)較多時(shí)，可以在上樣后停止流動(dòng),，讓樣品在層析柱中反應(yīng)一段時(shí)間,，或者將上樣后流出液進(jìn)行二次上樣，以增加吸附量,。樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強(qiáng)的親和力,。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強(qiáng)度，以減小基質(zhì),、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附,。

 

生物分子間的親和力是受溫度影響的，通常親和力隨溫度的升高而下降,。所以在上樣時(shí)可以選擇適當(dāng)較低的溫度,，使待分離的物質(zhì)與配體有較大的親和力，能夠充分的結(jié)合;而在后面的洗脫過程可以選擇適當(dāng)較高的溫度,，使待分離的物質(zhì)與配體的親和力下降,，以便于將待分離的物質(zhì)從配體上洗脫下來。

 

上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質(zhì),。平衡緩沖液的流速可以快一些,，但如果待分離物質(zhì)與配體結(jié)合較弱，平衡緩沖液的流速還是較慢為宜,。如果存在較強(qiáng)的非特異性吸附,，可以用適當(dāng)較高離子強(qiáng)度的平衡緩沖液進(jìn)行洗滌，但應(yīng)注意平衡緩沖液不應(yīng)對(duì)待分離物質(zhì)與配體的結(jié)合有明顯影響,，以免將待分離物質(zhì)同時(shí)洗下,。

 

2.洗脫

 

親和層析的另一個(gè)重要的步驟就是要選擇合適的條件使待分離物質(zhì)與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫,。

 

（1）特異性洗脫

 

特異性洗脫是指利用洗脫液中的物質(zhì)與待分離物質(zhì)或與配體的親和特性而將待分離物質(zhì)從親和吸附劑上洗脫下來,。

 

特異性洗脫也可以分為兩種：一種是選擇與配體有親和力的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，另一種是選擇與待分離物質(zhì)有親和力的物質(zhì)進(jìn)行洗脫,。前者在洗脫時(shí),，選擇一種和配體親和力較強(qiáng)的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)配體的結(jié)合,，在適當(dāng)?shù)臈l件下,，如這種物質(zhì)與配體的親和力強(qiáng)或濃度較大，配體就會(huì)基本被這種物質(zhì)占據(jù),，原來與配體結(jié)合的待分離物質(zhì)被取代而脫離配體,，從而被洗脫下來,。例如用凝集素作為配體分離糖蛋白時(shí)，可以用適當(dāng)?shù)膯翁窍疵?，單糖與糖蛋白競(jìng)爭(zhēng)對(duì)凝集素的結(jié)合，可以將糖蛋白從凝集素上置換下來,。后一種方法洗脫時(shí),，選擇一種與待分離物質(zhì)有較強(qiáng)親和力的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與配體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)待分離物質(zhì)的結(jié)合,，在在適當(dāng)?shù)臈l件下,，如這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)的親和力強(qiáng)或濃度較大，待分離物質(zhì)就會(huì)基本被這種物質(zhì)結(jié)合而脫離配體,，從而被洗脫下來,。例如用染料作為配體分離脫氫酶時(shí)，可以選擇NAD+進(jìn)行洗脫,，NAD+是脫氫酶的輔酶,，它與脫氫酶的親和力要強(qiáng)于染料，所以脫氫酶就會(huì)與NAD+結(jié)合而從配體上脫離,。特異性洗脫方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng),，可以進(jìn)一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率,。另外對(duì)于待分離物質(zhì)與配體親和力很強(qiáng)的情況,，使用非特異性洗脫方法需要較強(qiáng)烈的洗脫條件，很可能使蛋白質(zhì)等生物大分子變性,，有時(shí)甚至只能使待分離的生物大分子變性才能夠洗脫下來,，使用特異性洗脫則可以避免這種情況。由于親和吸附達(dá)到平衡比較慢,，所以特異性洗脫往往需要較常的時(shí)間和較大的洗脫條件,，可以通過適當(dāng)?shù)母淖兤渌鼦l件，如選擇親和力強(qiáng)的物質(zhì)洗脫,、加大洗脫液濃度等等,，來縮小洗脫時(shí)間和洗脫體積。

 

（2）非特異性洗脫

 

非特異性洗脫是指通過改變洗脫緩沖液pH,、離子強(qiáng)度,、溫度等條件，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來,。

 

當(dāng)待分離物質(zhì)與配體親和力較小時(shí),，一般通過連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，就可以在雜質(zhì)之后將待分離物質(zhì)洗脫下來,，這種洗脫方式簡(jiǎn)單,、條件溫和,，不會(huì)影響待分離物質(zhì)的活性。但洗脫體積一般比較大,，得到的待分離物質(zhì)濃度較低,。當(dāng)待分離物質(zhì)和配體結(jié)合較強(qiáng)時(shí)，可以通過選擇適當(dāng)?shù)膒H,、離子強(qiáng)度等條件降低待分離物質(zhì)與配體的親和力,，具體的條件需要在實(shí)驗(yàn)中摸索?？梢赃x擇梯度洗脫方式,，這樣可能將親和力不同的物質(zhì)分開。如果希望得到較高濃度的待分離物質(zhì),，可以選擇酸性或堿性洗脫液,，或較高的離子強(qiáng)度一次快速洗脫，這樣在較小的洗脫體積內(nèi)就能將待分離物質(zhì)洗脫出來,。但選擇洗脫液的pH,、離子強(qiáng)度時(shí)應(yīng)注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性，而且洗脫后應(yīng)注意中和酸堿,，透析去除離子,，以免待分離物質(zhì)喪失活性。對(duì)于待分離物質(zhì)與配體結(jié)合非常牢固時(shí),，可以使用較強(qiáng)的酸,、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性,，而從配體上解離出來,。然后再通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ勾蛛x物質(zhì)恢復(fù)活性。