摘要：

近年來，流式細胞分選和激光捕獲顯微切割技術(shù)的出現(xiàn)讓單細胞的捕獲成為可能,。不過，在獲得目的細胞之后,，如何與下游分析技術(shù)（如新一代測序和芯片）銜接呢,？單個細胞只含有pg級的DNA，細菌更是只有fg級的DNA,，但測序或芯片分析通常需要μg甚至mg級的DNA,。怎么辦？讓全基因組擴增來幫忙,！

在細胞分析中,，我們往往采用細胞群體，來獲取某個參數(shù)的平均值,。然而,，隨著細胞生物學的發(fā)展，我們逐漸意識到,，平均值已不再能滿足我們的要求,。對于一些復雜的組織，群體性研究只能獲得某些數(shù)量上占優(yōu)勢的細胞信息,，比如高度異質(zhì)性的實體瘤組織,。同時，還有一些細胞的量極少,，如產(chǎn)前診斷中的胎兒細胞或循環(huán)腫瘤細胞,。當然，別忘了自然界還存在各種各樣的微生物。其中,，大部分微生物不僅數(shù)量有限,，也無法用傳統(tǒng)的方法擴大培養(yǎng)。對于這些微量細胞的分析,，常規(guī)的技術(shù)顯然束手無策,。

全基因組擴增（whole gemome amplification）是對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術(shù)，其目的是在沒有序列偏向性的前提下大幅度增加DNA的總量,。之前人們常用基于PCR的擴增方法（如DOP-PCR和PEP-PCR）,，但這些方法不能對各個片段進行均勻地擴增，有可能產(chǎn)生擴增假象,。因此,，目前人們多采用多重置換擴增（MDA）方法。

號稱基因組復印機的QIAGEN REPLI-g試劑盒正是基于多重置換擴增技術(shù),，對有限的樣品進行快速,、均勻、無偏向的等溫全基因組擴增,，從而獲得更多遺傳信息,。原理是什么？請看圖1,。

圖1. 多重置換擴增（MDA）技術(shù)

在擴增過程中,，引物與模板DNA 退火，并利用在DNA 模板鏈上移動的Phi 29 聚合酶在30°C 延伸,，取代互補鏈,，同時自身成為復制的模板。與PCR 擴增不同,，MDA 不需要不同的溫度,，且zui終的片段非常長（2-70 kb），突變率低,。

之前QIAGEN已有多款REPLI-g試劑盒,，而新品REPLI-g Single Cell Kit則是專為單細胞研究人員而設計的。與之前的試劑盒相比,，它有兩點不同：采用優(yōu)化配方的高保真Phi 29 聚合酶,；增加了UV去污染步驟。

REPLI-g sc 聚合酶是高保真Phi 29 聚合酶的優(yōu)化配方,，具有強的置換活性,，可通過多重置換擴增（MDA）擴增復雜的基因組DNA，而溫和的堿變性步驟可防止DNA 片段化并產(chǎn)生脫堿基位點,。Phi 29 聚合酶確保了基因座的均勻擴增,，它zui多能復制70 kb 而不與基因組DNA 模板解離，實現(xiàn)了基因座的均勻擴增。Phi 29 聚合酶有著3’ → 5’ 的核酸外切酶校正活性,，在復制時其保真度比Taq DNA 聚合酶高出1000 倍，從而避免了擴增偏向或突變,。相比之下,，那些基于PCR的擴增方法會導致擴增片段短且容易出錯，帶來單堿基對突變,、STR縮小和擴大,。

同時，REPLI-g Single Cell Kit 使用專門的緩沖液和試劑,，反應設置相當簡單,，且處理時間僅為15 分鐘。這些*的組分,，再加上標準化的UV 處理步驟,，能夠消除任何可檢測到的殘留DNA污染，確保高質(zhì)量結(jié)果僅僅來自您那個寶貴的細胞,。此試劑盒也可使用已純化的基因組DNA,、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織,。

表1. REPLI-g Single Cell Kit的組分

這下,，哪怕只有一個細胞在手，您也可以大膽地開展各種下游分析了吧,。經(jīng)REPLI-g Single Cell擴增后,，DNA產(chǎn)物平均長度超過10 kb，產(chǎn)量高達40 μg,，且完整覆蓋基因組,，高度適合也已經(jīng)開發(fā)用于新一代測序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或qPCR分析,。

圖2. 完整的基因組覆蓋,。利用RT2 qPCR Primer Assays（QIAGEN）以及REPLI-g Single Cell Kit 在3 個不同的單細胞實驗中擴增DNA 后開展實時定量PCR，對整個人類基因組中分布在不同染色體上的267 個基因座進行全面分析,。低且一致的CT 值,、無任何標記的丟失，表明基因組中所有區(qū)域的成功擴增,，高度適合單細胞基因組學,。

當然，事實勝于雄辯,。東西好不好,，用過了才有發(fā)言權(quán)。好吧，現(xiàn)在請客戶來發(fā)言,。

*位是華大基因研究員宋盧挺,。他之前一直用REPLI-g mini kit，這一次評估了REPLI-g Single Cell Kit,。他選用正常的淋巴細胞系樣品,，分別做了1個無擴增的大量細胞（>1000000個）、1個Qiagen REPLI-g single cell kit單細胞,、3個Qiagen REPLI-g mini kit單細胞,、1個Qiagen REPLI-g mini kit多細胞（約15細胞）樣品的約0.5x全基因組測序。

他認為,，相對于原REPLI-g mini kit,，新的single cell kit可極大地降低擴增偏向性，實現(xiàn)全基因組較均一的擴增（接近無擴增的效果）,，使此試劑盒產(chǎn)物有了同時可檢測SNP和CNV,、SV的可能性。但在Mean Mapping Quality,、Read mapping ratio,、Read duplicated ratio等數(shù)據(jù)方面，因原REPLI-g mini kit效果已較好,，無變化,。

第二位是新加坡基因組研究院的Masafumi Muratani 博士。他談道：“我已經(jīng)試過了這個試劑盒,，并成功開展了單細胞全基因組擴增,。所獲得的DNA 讓我能可靠檢測一個結(jié)腸直腸癌細胞系中等位基因特異的點突變。擴增后DNA 的出色產(chǎn)量和序列代表性確實幫助我推進了單細胞基因組學的研究工作,。”

有了身邊這兩位研究人員的現(xiàn)身說法,，現(xiàn)在您應該充滿信心了吧。如果您恰好在從事癌癥研究或宏基因組學研究,，那么不妨試試這個新產(chǎn)品,。