1 冷凍管應(yīng)如何解凍,？ 
取出冷凍管后,， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,， 否則易發(fā)生污染情形,。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全,， 預(yù)防冷凍管之爆裂,。 

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO,？ 
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細(xì)胞外,， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）,， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。 

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,？ 
不能,。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng),， 造成細(xì)胞無法存活。 

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類,？ 
不能,。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響,。來自不同物種的血清,， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活,。 

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思,， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼,， 請不要再使用,。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清,。
 
6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO2,？或根本沒有影響？ 
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度,。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7 何時須更換培養(yǎng)基,？ 
視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,，按時更換培養(yǎng)基即可,。
 
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 
除于特殊篩選系統(tǒng)中外,， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
 
9 附著性細(xì)胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理,？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na,。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于-20 °C,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,， 并可減少污染之機(jī)會。 

10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理,？ 
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時,， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,， 重復(fù)前述步驟即可。 

11 欲將一般動物細(xì)胞離心下來,，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速,？
欲回收動物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm）,，5 - 10 分鐘,， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡,。 

12 細(xì)胞之接種密度為何,？ 
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因,。 

13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何,？ 
動物細(xì)胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,， 必須使用前先行配制完成。 

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何,？ 
冷凍保存使用之DMSO 等級,， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況,， *次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì),， 并可減少污染之機(jī)會,。若要過濾DMSO,， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。 

15 冷凍保存細(xì)胞之方法,？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ （-20 °C30 分鐘*） → -80 °C 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存,。*-20 °C 不可超過1 小時,， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,，惟存活率稍微 降低一些。 

16 細(xì)胞欲冷凍保存時,， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度,？
 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。 

17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染,？ 
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌,、霉菌,、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng),、操作室環(huán)境不佳,、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù),、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。 

18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時,，應(yīng)如何處理,？ 
直接滅菌后丟棄之。 

19 支原體（mycoplasma） 污染的細(xì)胞,， 是否能以肉眼觀察出異狀,？ 
不能。除極有經(jīng)驗之專家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,， 無法以其外觀分辨之。 

20 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響,？ 
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù),， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 

21 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時,， 該如何處理,？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株,。 

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔,？ 
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 

23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 顏色會偏暗紅色,， 且pH值會越來越偏堿性？ 
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,， 可以通入無菌過濾之CO2,， 以調(diào)整pH 值。 

24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同,？ 
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同,， 制造程序亦不同,， 雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異,。 

25 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,， 大都是因為離心過程操作上的失誤,， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失,。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 

26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因,？ 
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳,。解凍過程錯誤,。冷凍細(xì)胞解凍后,， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤,。細(xì)胞置于-80 °C 太久。 

27 收到之冷凍管瓶身破裂,，瓶蓋有裂紋,，或瓶蓋脫落之原因？ 
冷凍管瓶蓋裂紋,，或瓶身破裂,，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損,，建議使用止血鉗小心夾取,。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊,。